蘇 晶，湯立忠，陳長(zhǎng)毅，陳 枚，劉 洋（淮安市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇淮安223001）

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定9種龍蝦中氨基糖苷類和四環(huán)素類抗生素殘留

蘇 晶，湯立忠，陳長(zhǎng)毅，陳 枚，劉 洋
（淮安市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇淮安223001）

建立了龍蝦中6種氨基糖苷類和3種四環(huán)素類抗生素殘留的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）同時(shí)檢測(cè)方法。樣品中抗生素采用5%三氯乙酸-磷酸鹽溶液提取，經(jīng)超聲萃取、固相萃取柱凈化，C18色譜柱分離，對(duì)樣品前處理?xiàng)l件、液相色譜分離條件和質(zhì)譜檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)實(shí)際樣品添加回收率實(shí)驗(yàn)，鏈霉素、雙氫鏈霉素、四環(huán)素、金霉素和土霉素定量檢出限均為5 μg/kg，慶大霉素、卡那霉素、新霉素和妥布霉素定量檢出限均為50 μg/kg，9種抗生素三個(gè)添加水平下，龍蝦樣品加標(biāo)回收率在66.1%～107.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.7%～9.7%。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、高效，適用于龍蝦中6種氨基糖苷類和3種四環(huán)素類藥物殘留的同時(shí)檢測(cè)和確證。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，氨基糖苷類抗生素，四環(huán)素類抗生素，龍蝦

抗生素在我國(guó)畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，不但被廣泛應(yīng)用于防治各種動(dòng)物性疾病，而且常被添加到飼料中，用于促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育［1-2］，這不可避免造成抗生素在食品中的殘留，對(duì)食品安全、生態(tài)環(huán)境和人體健康造成直接或潛在的危害［3］。氨基糖苷類抗生素和四環(huán)素類抗生素均為廣譜抗菌藥，廣泛用于防治動(dòng)物和水產(chǎn)品的疾病感染和促進(jìn)生長(zhǎng)［4-5］。目前，許多國(guó)家和地區(qū)制定了四環(huán)素類和氨基糖苷類藥物最大殘限量，國(guó)際貿(mào)易中也有嚴(yán)格的限定。聯(lián)合食品添加劑委員會(huì)、歐盟、美國(guó)及日本對(duì)肉中四環(huán)素類和氨基糖苷類藥物殘留的最大限量在50～600 μg/kg之間［6-7］。我國(guó)規(guī)定魚(yú)蝦肉中四環(huán)素、土霉素、金霉素的最高限量為100 μg/kg，肌肉中新霉素最高限量為500 μg/kg，慶大霉素為100 μg/kg［8］。韓國(guó)和日本對(duì)我國(guó)出口水產(chǎn)品中氨基糖苷類藥物殘留要求控制在200 μg/kg以下。

近年來(lái)，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)因能有效實(shí)現(xiàn)抗生素的確證和定量，成為研究關(guān)注的焦點(diǎn)。液相色譜質(zhì)譜法檢測(cè)蜂蜜［9］、乳制品［10-11］及動(dòng)物源性食品［6，12］中氨基糖苷類的方法有較多報(bào)道。然而，該類抗生素具有較強(qiáng)的極性，在常規(guī)反相色譜柱上的保留性較差，常加入離子對(duì)試劑以增強(qiáng)其在色譜柱上的保留性［6］，但其對(duì)質(zhì)譜離子化具有抑制作用。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的親水作用色譜柱（HILIC柱）在該類抗生素檢測(cè)分離上也開(kāi)展了相關(guān)的研究［2］，但該色譜柱價(jià)格昂貴，成本較高。有關(guān)四環(huán)素類藥物殘留的液相色譜質(zhì)譜檢測(cè)法的報(bào)道越來(lái)越多，其共同特點(diǎn)是靈敏度高，涉及藥物的種類更多［13-16］。目前，關(guān)于氨基糖苷類和四環(huán)素類藥物殘留同時(shí)檢測(cè)的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用超聲提取、HLB柱凈化法提取目標(biāo)物，以C18柱進(jìn)行分離，流動(dòng)相中舍棄了離子對(duì)試劑的使用，建立了HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定龍蝦中6種氨基糖苷類和3種四環(huán)素類藥物殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素 純度均≥90%Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈 色譜級(jí)，德國(guó)Merker公司；甲酸 色譜級(jí)，德國(guó)CNW公司；三氯乙酸（TCA）、Na2EDTA、磷酸二氫鉀 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Poly-Sery HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL）

上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水 由Milli-Q純水機(jī)制得。

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、TSQ Quantum Access三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、Accela U-HPLC 美國(guó)Thermo公司；KH-100B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；T18型高速勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；KW-80A型漩渦混合器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；Milli-Q超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 熟龍蝦樣品取肌肉部分，用食品料理機(jī)勻漿，制成均勻樣品，-18℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 分別稱取各抗生素標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于10 mL容量瓶中，氨基糖苷類抗生素以純水定容至刻度，四環(huán)素類抗生素用乙腈水（體積比為50∶50）定容至刻度，得1.0 mg/mL各抗生素單標(biāo)儲(chǔ)備液，于塑料管中4℃避光保存。

1.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制 分別移取一定量的各抗生素單標(biāo)儲(chǔ)備液，用乙腈水（體積比為20∶80）稀釋成5 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。用乙腈-0.1%甲酸溶液（體積比為20∶80）將混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4 樣品處理 參考Tao等［6］的方法，并進(jìn)行了改進(jìn)。稱取5.00 g均質(zhì)后的龍蝦樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL 5%三氯乙酸-10 mmol/L磷酸鹽（含4 mmol/L Na2EDTA）提取液，高速勻漿1 min，超聲提取10 min，4℃12000 r/min離心10 min。將上清液收集至另一離心管中，殘?jiān)僖?0 mL提取液重復(fù)提取一次，收集兩次上清液，調(diào)整pH，4℃12000 r/min離心10 min，取上清液備用。在取上清液10 mL全部通過(guò)HLB固相萃取柱（預(yù)先以5 mL甲醇，5 mL水活化），以5 mL水淋洗柱體，25 MPa加壓抽干10 min。以6 mL甲醇洗脫柱體，于40℃氮?dú)獯蹈?，? mL乙腈-0.1%甲酸（體積比為20∶80）溶解，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后待測(cè)定。

1.2.5 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件 色譜柱：Agilent Ecilpse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相為0.05%甲酸乙腈，B為0.05%甲酸水；梯度洗脫程序見(jiàn)表為：15%A 0～1.0 min；15%～60%A 1.0～5.0 min；60%A 5.0～17.5 min；60%～85%7.5～10 min；85%～15%A 10～15 min；15%A 15～20 min，流速0.2 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣體積20 μL。質(zhì)譜離子源為ESI（+），噴霧電壓：4000 V；離子源溫度：320℃；鞘氣：245 kPa；輔氣：70 kPa；碰撞池電壓1.5 mTorr，各抗生素選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式監(jiān)測(cè)參數(shù)，見(jiàn)表1。

表1 9種抗生素質(zhì)譜分析參數(shù)Table1 MS/MS parameters of 9 antibiotics

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

圖1 不同pH對(duì)9種抗生素回收率的影響Fig.1 Effect of different pH values on extracted recoveries of 9 antibiotics

目前，肌肉組織中四環(huán)素類抗生素的提取方法已較成熟，主要以EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH4.0）提取液進(jìn)行提?。?3，15］。實(shí)驗(yàn)以該提取液同時(shí)提取氨基糖苷類抗生素和四環(huán)素類抗生素，其中鏈霉素、雙氫鏈霉素、四環(huán)素、金霉素和土霉素添加量為25 μg/kg，慶大霉素、卡那霉素、新霉素和妥布霉素添加量為250 μg/kg，結(jié)果3種四環(huán)素類抗生素回收率均達(dá)85%以上，而6種氨基糖苷類抗生素回收率幾乎為0。因此，實(shí)驗(yàn)考察了5%三氯乙酸-10 mmol/L磷酸鹽（含4 mmol/L Na2EDTA）溶液對(duì)9種抗生素的提取回收率，以及調(diào)整提取液pH對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明提取液pH的變化對(duì)6種氨基糖苷類抗生素的影響較大，當(dāng)調(diào)整提取上清液pH至3.0時(shí)，9種抗生素回收率最好，回收率均大于65%，最高接近100%（見(jiàn)圖1）。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

氨基糖苷類和四環(huán)素類抗生素在質(zhì)譜上具有很強(qiáng)的正離子響應(yīng)，因此選擇正離子模式進(jìn)行掃描。以1.0 μg/mL抗生素單標(biāo)溶液采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣分析，在正離子模式下，9種抗生素一級(jí)質(zhì)譜均出現(xiàn)［M+H］+準(zhǔn)分子離子峰，且豐度較大，因此選擇分子離子峰作為母離子。分別對(duì)9中抗生素母離子進(jìn)行轟擊碎裂，得到特征碎片離子峰信息，確定各目標(biāo)物的特征子離子，具體見(jiàn)表1。在SRM模式下優(yōu)化碰撞能量、Tube lens去簇電壓，最后在液相色譜聯(lián)機(jī)條件下優(yōu)化噴霧電壓、離子化溫度、鞘氣和輔助氣流量等參數(shù)，確定最佳質(zhì)譜檢測(cè)條件，見(jiàn)1.2.5所述。

2.3 色譜條件的選擇

以C18色譜柱作為分析柱，流動(dòng)相中為加入離子對(duì)試劑。通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)，比較了Thermo Hypersil Gold C18（2.1 mm×100 mm，5 μm）、Waters Symmetry?C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）和Agilent Eclipse XDB-C18四種色譜柱對(duì)6種氨基糖苷類和3種四環(huán)素類抗生素的分離效果。結(jié)果表明9種抗生素在Thermo Hypersil Gold C18和Waters Symmetry?C18上幾乎無(wú)保留，在Agilent Eclipse Plus C18和Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱上有保留性。Agilent Eclipse XDB-C18能夠?qū)崿F(xiàn)堿性、酸性和中性化合物的良好分離，在寬pH2～9范圍內(nèi)能提供良好的峰形，9種抗生素分離效果最佳，峰型良好，因此選擇該色譜柱作為分析柱。比較了乙腈-水、甲醇-水為流動(dòng)相、流動(dòng)相中添加甲酸、乙酸、甲酸銨對(duì)抗生素色譜分離效果的影響，最終確定流動(dòng)相為0.5%甲酸乙腈-0.5%甲酸水時(shí)，9種抗生素色譜分離和質(zhì)譜響應(yīng)效果最佳。通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫條件，獲得了9個(gè)目標(biāo)物合適的保留時(shí)間和峰形，9種抗生素SRM模式監(jiān)測(cè)提取色譜圖見(jiàn)圖2。

2.4 方法的線性關(guān)系與檢出限

圖2 9種抗生素SRM選擇監(jiān)測(cè)提取色譜圖Fig.2 SRM chromatograms of 9 antibiotics

以9種抗生素的色譜峰面積（Y）和質(zhì)量濃度（X）做線性回歸，結(jié)果顯示鏈霉素、雙氫鏈霉素、四環(huán)素、金霉素和土霉素在5～250 μg/L范圍內(nèi)，慶大霉素、卡那霉素、新霉素和妥布霉素在50～2500 μg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系均良好（r＞0.99），見(jiàn)表2。通過(guò)陰性龍蝦樣品加標(biāo)測(cè)定，鏈霉素、雙氫鏈霉素、四環(huán)素、金霉素和土霉素添加水平在5 μg/kg，其信噪比（S/N）均大于10，表明以上5種抗生素的定量檢測(cè)下限可達(dá)5 μg/kg，卡那霉素、妥布霉、新霉素和慶大霉素素添加水平在50 μg/kg，其信噪比（S/N）均大于10，表明其定量檢測(cè)下限可達(dá)50 μg/kg。

表2 9種抗生素的線性范圍和線性方程Table2 Linear ranges and regression on equations for 9 antibiotics

表3 龍蝦中9種抗生素的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table3 Results of recovery and repeatability for 9 antibiotics in crayfish（n=6）

2.5 方法的回收率和精密度考察

以均質(zhì)后的空白龍蝦樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定。四環(huán)素、土霉素、金霉素、鏈霉素和雙氫鏈霉分別添加5、12.5、50 μg/kg 3個(gè)水平，慶大霉素、卡那霉素、新霉素、妥布霉素分別添加50、125、500 μg/kg 3個(gè)水平，按所建方法進(jìn)行樣品處理和測(cè)定，平均加標(biāo)回收率和精密度見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，龍蝦中9種抗生素平均加標(biāo)回收率在66.1%～107.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.7%～9.7%，能夠滿足檢測(cè)方法的要求。

2.6 實(shí)際樣品中9種抗生素殘留檢測(cè)

采用本方法對(duì)我單位2015年二季度送檢的8個(gè)龍蝦樣品進(jìn)行檢測(cè)，未檢出以上9種抗生素殘留。

3 結(jié)論

建立了龍蝦產(chǎn)品中鏈霉素、雙氫鏈霉素、妥布霉素、新霉素、慶大霉素、卡那霉素6種氨基糖苷類和四環(huán)素、土霉素、金霉素3種四環(huán)素類抗生素殘留的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)方法。該方法以5% TCA-磷酸鹽緩沖液提取樣品中目標(biāo)物，以HLB柱富集凈化，有效去除了基質(zhì)干擾，提高了回收率。通過(guò)優(yōu)化液相色譜和質(zhì)譜檢測(cè)條件，建立的HPLC-MS/MS方法具有較高的靈敏度和較低的檢出限，在實(shí)際檢測(cè)工作中具有良好應(yīng)用價(jià)值。

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Simultaneous determination of nine aminoglycosides and tetracyclines antibiotics residues in crayfish by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

SU Jing，TANG Li-zhong，CHEN Chang-yi，CHEN Mei，LIU Yang
（Huaian Institute of Supervision&Inspection on Product Quality，Huaian 223001，China）

A method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/ MS）had been developed for simultaneous determination of 6 aminoglycoside and 3 tetracycline antibiotics residues in crayfish.The antibiotics were ultrasonic extracted from crayfish muscles with 5%trichloroacetic acid-phosphate buffer solution，purified by hydrophilic-lipophilic balance（HLB）cartridge and separated by C18chromatographic column.The pre-treatment method，chromatographic and MS/MS parameters were optimized.The limits of detection for streptomycin，dihydrostreptomycin，tetracycline，chlortetracycline and oxytetracy-cline were 5 μg/kg，respectively，and for gentamycin，kanamycin，neomycin andtobramycin 50 μg/kg，respectively.The recoveries of 9 antibiotics residues at three spike levels ranged from 66.1%to 107.9%with the relative standards deviations of 0.7%～9.7%.The established method was accurate and effective for confirmation and quantification of 9 different aminoglycoside and tetracycline antibiotics residues in crayfish.

HPLC-MS/MS；aminoglycosides；tetracyclines；crayfish

TS207.3

A

1002-0306（2016）02-0060-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.003

2015－06－10

蘇晶（1984-），女，博士，高級(jí)工程師，研究方向：食品與農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)，E-mail：surpumpkin@163.com。

淮安市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（HAS2012052）。