高雅，林自力，張鴻波，梁鴻斌，劉云海，郭勇，倪和民

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)系，北京 102206)

研究報(bào)告

自然發(fā)情與誘導(dǎo)發(fā)情小鼠子宮內(nèi)膜中雌激素受體α表達(dá)的比較

高雅，林自力，張鴻波，梁鴻斌，劉云海，郭勇，倪和民

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)系，北京 102206)

目的從雌激素受體α(ERα)的角度探討自然發(fā)情小鼠與誘導(dǎo)發(fā)情小鼠的子宮內(nèi)膜上，雌激素受體α表達(dá)是否受內(nèi)源雌激素的特異誘導(dǎo)而變化，兩者之間是否存在差異。方法27只同日齡母鼠，根據(jù)處理方式的不同隨機(jī)分為3個(gè)組:自然發(fā)情假孕組(對(duì)照組)、誘導(dǎo)發(fā)情處理假孕組和自然發(fā)情假孕第1天摘除卵巢組，3個(gè)組的小鼠在見(jiàn)栓后第4、6、8天分別取樣后，采用免疫組織化學(xué)法觀察小鼠子宮內(nèi)膜中雌激素受體α的表達(dá)情況。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，3個(gè)處理組的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞核、胞質(zhì)都有ERα存在，且主要表達(dá)在腺上皮;見(jiàn)栓第4、6、8天時(shí)，誘導(dǎo)發(fā)情處理組小鼠子宮內(nèi)膜的ERα陽(yáng)性率均顯著高于自然發(fā)情組和自然發(fā)情第1天摘除卵巢組(P＜0.05);見(jiàn)栓第8天時(shí)，自然發(fā)情處理組小鼠子宮內(nèi)膜中的ERα陽(yáng)性率與自然發(fā)情第1天摘除卵巢組差異不顯著(P＞0.05)，但見(jiàn)栓第4、6天時(shí)兩者陽(yáng)性率差異顯著，自然發(fā)情處理組小鼠子宮內(nèi)膜中的ERα陽(yáng)性率顯著高于自然發(fā)情第1天摘除卵巢組(P＜0.05)。結(jié)論誘導(dǎo)發(fā)情處理的小鼠子宮內(nèi)膜，其表面雌激素受體α表達(dá)顯著高于自然發(fā)情小鼠，且兩者都受其內(nèi)源性雌激素的特異誘導(dǎo)而變化。

小鼠;子宮內(nèi)膜;雌激素受體α;免疫組織化學(xué)

哺乳動(dòng)物的早期胚胎著床是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，當(dāng)胚胎著床時(shí)，母體子宮內(nèi)會(huì)分泌一些特殊蛋白以確保順利著床［1］，著床成功與否與胚胎正常發(fā)育、子宮內(nèi)膜的容受性及適宜的內(nèi)分泌環(huán)境密切相關(guān)［2］。雌激素是一種類固醇激素，主要在卵巢中合成，可以導(dǎo)致子宮內(nèi)膜在形態(tài)和生理方面的改變，從而影響子宮的容受性，保證胚胎的順利著床。一般認(rèn)為雌激素是通過(guò)和細(xì)胞內(nèi)特異性雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合，從而引發(fā)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄等一系列下游事件，產(chǎn)生生理學(xué)效應(yīng)［3］，所以比較子宮內(nèi)膜上ER的表達(dá)變化對(duì)探討改善動(dòng)物子宮的受容性有重要意義。

目前已知的雌激素受體有兩種，分別是ERα和ERβ，表達(dá)在不同動(dòng)物卵巢、睪丸、乳腺、小腦等組織上。通過(guò)基因敲除顯示:ERα敲除小鼠(αERKO)是高度不育的，這種小鼠的子宮發(fā)育不正常，子宮基質(zhì)組織結(jié)構(gòu)松散且發(fā)育不良［4－5］。而ERβ敲除小鼠(βERKO)雖然能生育，但是幼仔個(gè)體數(shù)目少且體型也較?。?］，說(shuō)明ERβ對(duì)小鼠胚胎著床的影響并不是很大，但可能對(duì)著床后的胚胎發(fā)育有直接影響。

目前已經(jīng)有人通過(guò)免疫組化的方法研究了不同動(dòng)物不同組織上兩種ER受體分布表達(dá)變化的情況，但針對(duì)同期發(fā)情處理后與自然發(fā)情小鼠子宮中ERα和ERβ的相應(yīng)差異變化研究卻未見(jiàn)報(bào)道。此外，由于在正常小鼠胚胎著床時(shí)子宮中的ERβ受體作用不明顯，所以在此不對(duì)其進(jìn)行研究。有鑒于此，本研究擬針對(duì)以上實(shí)際存在的問(wèn)題，從ERα的角度探討同期發(fā)情處理后，這些受體在小鼠子宮內(nèi)膜與自然發(fā)情同一時(shí)期小鼠的子宮內(nèi)膜上的分布表達(dá)是否存有差異，同時(shí)結(jié)合分析ERα的相應(yīng)分布是否受其內(nèi)源性雌激素的特異誘導(dǎo)，從而為提高體外受精胚胎移植妊娠率提供必要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:本實(shí)驗(yàn)選用ICR系小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2002－2003。母鼠為8周齡，體重28 g左右;公鼠8～24周齡，體重35 g左右。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:ERα兔單克隆抗體(Epitomics，1115－1);抗兔SABC試劑盒、3，3－二氧基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢市博士德生物工程公司);磷酸緩沖液(PBS)自配。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將27只母鼠隨機(jī)分為3個(gè)組:①自然發(fā)情假孕組(對(duì)照組):選擇陰門(mén)淡粉紅色的雌性青年鼠按1∶1的比例與成年結(jié)扎公鼠合籠過(guò)夜交配，次日早8:00檢查交配情況。見(jiàn)陰道栓者即可以用于實(shí)驗(yàn)并以見(jiàn)栓當(dāng)日記為妊娠1 d。②同期發(fā)情處理假孕組:于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的當(dāng)天19:00，選擇陰門(mén)淡粉紅色的雌性青年鼠，每只腹腔注射PMSG 10 IU，間隔46 h，于隔天的17∶00腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)每只15 IU。注射hCG后按1∶1的比例與成年結(jié)扎公鼠合籠過(guò)夜交配，次日早8:00檢查交配情況。見(jiàn)陰道栓者即可以用于實(shí)驗(yàn)。③自然發(fā)情假孕第1天摘除卵巢組:選擇陰門(mén)淡粉紅色的雌性青年鼠按1∶1的比例與成年結(jié)扎公鼠合籠過(guò)夜交配，次日早8∶00檢查交配情況。見(jiàn)陰道栓者于9∶00在麻醉?xiàng)l件下切除雙側(cè)卵巢即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 樣本采集:3個(gè)處理組見(jiàn)栓后的小鼠，分別于見(jiàn)栓后第4、6、8天隨機(jī)各選取3只，處死后取出子宮，生理鹽水沖洗，4%的多聚甲醛4℃浸漬固定48～96 h。

1.2.3 免疫組化SABC法操作程序:①常規(guī)石蠟包埋、切片;②切片脫蠟至水，3%H2O2室溫30 m in以滅活內(nèi)源性酶PBS沖洗一下;③0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù)，PBS洗3次;④5% BSA在37℃作用40 min;⑤一抗兔抗ER多抗(1∶50)4℃過(guò)夜，PBS洗3次;⑥生物素化羊抗兔IgG在37℃孵育30 min，PBS洗3次;⑦滴加SABC 37℃30 m in，PBS洗4次;⑧DAB顯色5 m in;⑨蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。

陰性對(duì)照以0.01 mol/L的PBS液代替⑤中的一抗，其余步驟同上。

1.2.4 圖像分析:將子宮內(nèi)膜細(xì)胞按照子宮腺上皮細(xì)胞、子宮腔上皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞三種細(xì)胞類型分別計(jì)數(shù):隨機(jī)選取5張切片，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，取5個(gè)視野的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率(陽(yáng)性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù))均值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件單因素方差，Duncan檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)相關(guān)分析結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±s)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠子宮內(nèi)膜中ER表達(dá)分布

免疫組化染色陽(yáng)性切片背景無(wú)色或淡藍(lán)色，ER免疫反應(yīng)物質(zhì)為黃色或棕黃色;陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中著有黃色或棕黃色反應(yīng)顆粒，陰性細(xì)胞的細(xì)胞核被蘇木素染成淡藍(lán)色或藍(lán)色。對(duì)照組切片染色陰性，背景無(wú)色或淡藍(lán)色，無(wú)黃色或棕黃色染色，說(shuō)明免疫組化SABC法具有ER免疫反應(yīng)的特異性。見(jiàn)圖1(封三)，箭頭所指為陽(yáng)性反應(yīng)物。

2.2 小鼠子宮內(nèi)膜中ER的陽(yáng)性率變化

2.2.1 各處理組子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中ERα在見(jiàn)栓第4、6、8天陽(yáng)性率的變化:見(jiàn)表1。

表1 各處理組子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中ERα在見(jiàn)栓第4、6、8天陽(yáng)性率的變化(陽(yáng)性百分比)(±s)Tab.1 The intensity of ERα expression in glandular epithelium(The rate of positive staining)(±s)

表1 各處理組子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中ERα在見(jiàn)栓第4、6、8天陽(yáng)性率的變化(陽(yáng)性百分比)(±s)Tab.1 The intensity of ERα expression in glandular epithelium(The rate of positive staining)(±s)

注:上標(biāo)相同字母表示差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，字母不同表示差異有顯著性(P＜0.05)。Note:The same letters indicate non－significant differences among them(P＞0.05).The different letters indicate a significant difference among them(P＜0.05).

組別Group第4天Day 4第6天Day 6第8天Day 8自然發(fā)情假孕組Natural estrus pseudocyesis 0.54194±0.0499b0.36280±0.0814b0.44777±0.1317b同期發(fā)情處理假孕組Estrus synchronization and pseudocyesis 0.71983±0.0738a0.64532±0.1083a0.77763±0.0407a自然發(fā)情假孕第1天摘除卵巢組Natural estrus，pseudocyesis and being ovariectomized at the first day of estrus 0.29302±0.2182c0.22226±0.0761c0.31469±0.1744b

從表1可以看出:同期發(fā)情處理假孕組小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞ER陽(yáng)性率在見(jiàn)栓第4、6、8天均顯著高于自然發(fā)情組和自然發(fā)情假孕第1天摘除卵巢組(P＜0.05)。自然發(fā)情假孕第1天摘除卵巢組在見(jiàn)栓的第8天與自然發(fā)情假孕組差異無(wú)顯著性，但第4、6天時(shí)則顯著低于自然發(fā)情組(P＜0.05)。

2.2.2 各處理組子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞中ERα在見(jiàn)栓第4、6、8天陽(yáng)性率的變化:在該實(shí)驗(yàn)中，只在自然發(fā)情第6天和誘導(dǎo)發(fā)情第6天的小鼠子宮內(nèi)膜腔上皮上檢測(cè)到ER的表達(dá)，其余各組均未檢測(cè)到ERα的表達(dá)。

2.2.3 各處理組子宮內(nèi)膜腺基質(zhì)細(xì)胞中ERα在見(jiàn)栓第4、6、8天陽(yáng)性率的變化:在該實(shí)驗(yàn)中，未檢測(cè)到子宮內(nèi)膜腺基質(zhì)細(xì)胞中有ER的表達(dá)。

3 討論

ER在小鼠子宮內(nèi)膜中的分布是受雌激素調(diào)節(jié)的。經(jīng)典的雌激素作用模式是與雌激素受體結(jié)合，通過(guò)靶基因上游的雌激素反應(yīng)元件調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，這種機(jī)制被稱為雌激素的基因組作用模式，需要雌激素與ER形成復(fù)合體后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核才能發(fā)揮作用［7］。然而，隨著研究的不斷深入，也有研究表明除經(jīng)典的基因組作用模式外，雌激素還存在非基因組作用模式，這種作用模式不需要雌激素進(jìn)入細(xì)胞核，而是通過(guò)分布于細(xì)胞膜的雌激素結(jié)合蛋白，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)［7］。因此，雌激素受體既表達(dá)于胞核中，也表達(dá)于胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。本實(shí)驗(yàn)中，在各處理組的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均可檢測(cè)到ERα，說(shuō)明ERα通過(guò)激活不同的信號(hào)途徑介導(dǎo)了不同的調(diào)控作用。

本實(shí)驗(yàn)選擇在見(jiàn)栓后的第4、6、8天檢測(cè)ERα，主要是因?yàn)樾∈笈咛ブ餐ǔ０l(fā)生在見(jiàn)栓后的第4天，此時(shí)小鼠體內(nèi)的E2分泌會(huì)達(dá)到一個(gè)高峰，通過(guò)觀察幾個(gè)不同處理組的小鼠子宮內(nèi)膜中ER的表達(dá)分布情況，從而可以比較幾組處理小鼠子宮中ER在胚胎著床前后的表達(dá)分布是否存在差異。本實(shí)驗(yàn)中設(shè)有一自然發(fā)情假孕第1天摘除卵巢組，目的在于雌激素主要在卵巢中合成，摘除卵巢后可以觀察到小鼠子宮內(nèi)膜中的ERα是否受到來(lái)自卵巢的內(nèi)源性雌激素的影響。從結(jié)果可以看出，自然發(fā)情假孕第1天摘除卵巢組小鼠子宮內(nèi)膜中的ERα陽(yáng)性率在見(jiàn)栓第4、6天時(shí)均顯著低于另外兩組，且在見(jiàn)栓第8天仍顯著低于誘導(dǎo)發(fā)情組，這說(shuō)明不同處理方法的小鼠子宮內(nèi)膜中ERα在胚胎著床前后的表達(dá)存在差異。此外，自然發(fā)情假孕第1天摘除卵巢組的小鼠可能是由于摘除卵巢后缺少了內(nèi)源性雌激素，使得ERα的表達(dá)下降，從而可以推測(cè)小鼠子宮內(nèi)膜中ERα的分布受到內(nèi)源性雌激素的特異誘導(dǎo)而變化。另外，本實(shí)驗(yàn)中的誘導(dǎo)發(fā)情采用了PMSG +hCG的組合，由于PMSG半衰期較長(zhǎng)，在體內(nèi)不容易及時(shí)清除，從而會(huì)影響卵泡的發(fā)育和及時(shí)排卵，繼而產(chǎn)生不能排卵的大卵泡，而大卵泡可分泌雌二醇，造成胚胎著床前后一段的時(shí)期內(nèi)外周血液中E2水平較高［8－9］，從而影響子宮內(nèi)膜中ERα的表達(dá)，因此推斷可能內(nèi)源性雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜中ER的表達(dá)具有上調(diào)作用。

本實(shí)驗(yàn)中，在各處理組的腺上皮中都檢測(cè)到了ERα的存在，這說(shuō)明ERα影響子宮腺體的發(fā)育，與前人研究的ERα敲除小鼠的子宮腺體數(shù)量少相一致。但是在子宮內(nèi)膜基質(zhì)上并沒(méi)有檢測(cè)到ERα的存在，這與張翼海［10］及連艷［11］的結(jié)果相一致，但與Bruce等的結(jié)果不一致，他們?cè)谡Ｅ宰訉m內(nèi)膜的基質(zhì)細(xì)胞中也檢測(cè)到ERα的存在［1］。另外，本實(shí)驗(yàn)也只在見(jiàn)栓第6天的自然發(fā)情組和同期發(fā)情組的小鼠子宮內(nèi)膜腔上皮檢測(cè)到ERα，因此推測(cè)可能在見(jiàn)栓后不同時(shí)期，由于雌激素的影響，ERα通過(guò)激活不同定位的信號(hào)途徑來(lái)介導(dǎo)調(diào)控作用。

綜上所述，同期發(fā)情處理和自然發(fā)情的小鼠在胚胎著床階段其子宮內(nèi)膜上的ERα分布是存有明顯差異的，這可能會(huì)進(jìn)一步影響胚胎著床的過(guò)程以及胚胎移植的妊娠率。

(本文圖1見(jiàn)封三。)

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Com parison of the Expression of Estrogen Receptor α in M ouse Endom etrium between Those Treated by Estrus Synchronization and in Natural Estrus

GAO Ya，LIN Zi－li，ZHANG Hong－bo，LIANG Hong－bin，LIU Yun－h(huán)ai，GUO Yong，NI He－m in (Department of Animal Science＆Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China)

ObjectiveTo investigate the distribution of estrogen receptor α(ERα)in the endometrium between the m ice treated by estrus synchronization and in natural estrus，and analyze whether such kind of ERα distribution is solely induced by endogeneous estrogen.M ethods According to the different treatments，total 27 ICR mice were divided into three groups:(1)the group in natural estrus and pseudocyesis(the control group)，(2)the group treated by estrus synchronization and pseudocyesis，(3)the group in natural estrus，pseudocyesis and being ovariectomized at the first day of estrus.ResultsThe results of immunohistochem istry showed that the estrogen receptor α distributed in both nucleus and cytoplasm，and ERα mainly expressed in glandular epithelium(GE).On day 4，6，8，the positive staining cell number in the estrus synchronization group was much higher than those of natural estrus(P＜0.05).On day 8，the positive staining cell number in the group of natural estrus and pseudocyesis and being ovariectomized at the first day of estrus，was not significantly different(P＞0.05)，but on Day 4 and 6，these data of the natural estrus group were significantly higher than those of the pseudocyesis one being ovariectomized at the first day of estrus(P＜0.05).ConlusionThe expression of ERα in mouse uterine endometrium by estrus synchronization is much higher than that of the natural estrus one.The ERαdistribution is mainly induced by their endogeneous estrogen.

Mouse;endometrium;estrogen receptor α;immunohistochemistry

R321－33

A

1005－4847(2010)02－0168－04

2010－02－22

北京市自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目“胚胎滋養(yǎng)層干細(xì)胞的功能性分析”(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào):5091002)，國(guó)家“十一五”“863計(jì)劃”重點(diǎn)項(xiàng)目“家畜卵泡高效誘導(dǎo)發(fā)育技術(shù)研究與應(yīng)用”(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào):2008AA101003)，國(guó)家“十一五科技支撐計(jì)劃”項(xiàng)目“肉羊高效育種關(guān)鍵技術(shù)的研究與應(yīng)用”(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào):2008BADB2B04－4)。

高雅(1984－)，女，北京人，碩士研究生，研究方向:產(chǎn)科及胚胎工程。

倪和民，男，副教授;研究方向:動(dòng)物產(chǎn)科及胚胎工程E－mail:nihemin@yahoo.com.cn