張琨，孫淑華，仉慧敏，胡小燕，王艷榮，孟金萍，劉云波

(北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，北京 100021)

研究報告

無菌豚鼠與普通豚鼠血液學參數(shù)的比較

張琨，孫淑華，仉慧敏，胡小燕，王艷榮，孟金萍，劉云波

(北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，北京 100021)

目的對普通級豚鼠進行剖宮產，培育無菌豚鼠模型，并比較無菌豚鼠和普通級豚鼠的血液學參數(shù)。方法行子宮摘除術摘除子宮，在無菌隔離器中將子宮剝離取仔，用人工哺乳的方法將仔豚鼠培育成無菌豚鼠，并在固定的周期檢測豚鼠的無菌情況。采用全血細胞計數(shù)分析儀、全自動血液生化分析儀測定無菌豚鼠、普通豚鼠的血常規(guī)和血生化參數(shù)。用SPSS12.0進行統(tǒng)計分析。結果無菌豚鼠和普通豚鼠在白細胞(WBC)、嗜堿性粒細胞數(shù)(BA#)、單核細胞百分比(MO)、血紅蛋白濃度(MCHC)、中性粒細胞數(shù)(NE#)、嗜酸性粒細胞數(shù)(EO#)、淋巴細胞數(shù)(LY#)七個血常規(guī)指標上有差異顯著性，其他指標沒有顯著性差異;谷丙轉氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(CHO)、總膽紅素(TBIL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)、甘油三酯(TG)、球蛋白(GLO)、A/G、K、Na、谷酰轉肽酶(GGT)15個指標上差異有顯著性，其他指標差異無顯著性。結論通過規(guī)范的子宮摘除術和人工喂養(yǎng)的方法獲得符合標準的無菌豚鼠，與普通豚鼠在多項血液學指標上差異有顯著性。

剖宮產手術;無菌豚鼠;血常規(guī);血生化

19世紀末期開始，無菌動物和SPF動物的研究逐步興起，相繼培育出了各種無菌實驗動物，1932年Glimstedt成功將無菌豚鼠培育兩個月［1］。我所自1980年開始研究無菌豚鼠并培育成功。

目前國內還沒有對無菌豚鼠的生物學特性進行系統(tǒng)的觀察比較，無菌豚鼠也沒有作為實驗動物模型在科學研究中進行規(guī)模化的應用。本實驗對無菌豚鼠的培育進行了規(guī)范化研究，并對無菌豚鼠的血液學參數(shù)進行測定，為無菌豚鼠的使用和推廣提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:①普通豚鼠一:普通級臨產豚鼠，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心【SCXK(京)2007－2003】，自然生產，10只仔鼠，與其母親合養(yǎng)一周后放入隔離器中飼養(yǎng)。②普通豚鼠二:10只，購自北京科宇實驗動物養(yǎng)殖中心【SCXK(京)2007－2003】。③無菌豚鼠:普通級臨產豚鼠，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心【SCXK(京)2007－2003】，用CO2氣體麻醉后進行子宮摘除術，逐層開腹，暴露子宮，用止血鉗夾住子宮頸和兩邊輸卵管，從遠離子宮端剪斷輸卵管和子宮頸，將子宮通過過氧乙酸池傳入無菌隔離器中，擠出胎仔，輕輕按摩仔豚鼠使其自主呼吸，1～2h后開始人工喂養(yǎng)，豚鼠出生第2天便可自主進食。獲仔鼠10只，在無菌隔離器中人工飼養(yǎng)。

1.1.2 儀器:7020型日立生化分析儀，日本株式會社日立高新技術公司生產。

1.1.3 飼養(yǎng)環(huán)境:塑料薄膜隔離器;潔凈度百級;壓力梯度:塑料薄膜隔離器對外界48 Pa;換氣次數(shù)每小時56次;環(huán)境溫度20～25℃;相對濕度40%～65%。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:將三種來源的動物分為3組:①第1組:普通級豚鼠，30～40日齡，飼養(yǎng)環(huán)境為普通環(huán)境，體重220～240 g。②第2組:普通級豚鼠，30～40日齡，飼養(yǎng)環(huán)境為隔離環(huán)境，體重180～230 g。③第3組:無菌級豚鼠，30～40日齡，飼養(yǎng)環(huán)境為隔離環(huán)境，體重138～185 g。

1.2.2 血液學指標測定:每只豚鼠心臟采血1.5 m L;0.5 m L EDTA抗凝，立刻測定血常規(guī);1 m L放入普通EP管中，靜置1h，3000 r/min離心15 min，取血清，測定血生化。由于無菌豚鼠比較敏感，每次采血前所有組不予禁食。

1.2.3 測定項目與方法

(1)自動生化測定儀:使用前按照儀器使用規(guī)程進行自檢，儀器各項參數(shù)正常后方可進行測定，而且質控標準品數(shù)值在正常范圍內，測定的數(shù)值才能有效。

(2)血生化檢測指標及方法:丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酸磷酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)使用連續(xù)檢測法;高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)使用清除法;尿素氮(BUN)使用酶偶速率法;肌酐(CRE)使用苦味酸法;尿酸(UA)使用尿酸酶－過氧化物酶法;白蛋白(ALB)使用溴甲酚綠法;總蛋白(TP)使用雙縮脲法;總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)使用酶比色法;葡萄糖使用葡萄糖氧化酶法。

(3)血常規(guī)檢測指標及方法:白細胞計數(shù)(WBC)、紅細胞計數(shù)(RBC)、紅細胞容積(HCT)、血小板計數(shù)(PLT)、平均血小板體積(MPV)使用阻抗法;血紅蛋白(HGB)使用分光光度計法;平均紅細胞容積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白(MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)使用計算法;白細胞分類使用ACV技術(雙聚焦流技術)。

1.2.4 統(tǒng)計學處理:所有數(shù)據(jù)用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計處理，比較豚鼠血液學參數(shù)的差異。

2 結果

2.1 無菌豚鼠微生物檢測結果

根據(jù)中華人民共和國無特定病原體動物、無菌動物生活環(huán)境及糞便標本的檢驗方法GB/T 14926. 41－2001，取無菌豚鼠的新鮮糞便，使用巰基乙醇培養(yǎng)基和馬丁培養(yǎng)基分別在37℃和27℃下進行培養(yǎng)，每日觀察并記錄檢測結果，均為陰性。

2.2 無菌豚鼠和普通豚鼠血常規(guī)測定結果

無菌豚鼠和普通豚鼠血常規(guī)測定結果見表1。用SPSS 12.0軟件對兩組豚鼠血常規(guī)進行獨立樣本T檢驗，與普通豚鼠相比，無菌豚鼠在白細胞(WBC)、單核細胞百分比(MO)、淋巴細胞數(shù)(LY #)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、中性粒細胞數(shù)(NE #)、嗜酸性粒細胞數(shù)(EO#)、嗜堿性粒細胞數(shù)(BA#) 7個指標上差異有顯著性(P＜0.05);在紅細胞(RBC)、平均紅細胞體積(MCV)、平均血紅蛋白含量(MCH)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞比容(HCT)、紅細胞體積分布寬度(RDW)、平均血小板體積(MPV)、單核細胞百分比(MO)中性粒細胞百分比(NE)、嗜酸性粒細胞百分比(EO)、嗜堿性粒細胞百分比(BA)、單核細胞數(shù)(MO#)等參數(shù)上差異無顯著性(P＞0.05)。

表1 無菌豚鼠、普通豚鼠一血液學常規(guī)數(shù)值比較Tab.1 Comparison of the values of routine blood test in the germ free and conventional guinea pigs

2.3 無菌豚鼠和普通豚鼠血生化測定結果

無菌豚鼠和普通豚鼠血生化測定結果見表2。用SPSS 12.0軟件對3組豚鼠血生化進行單因素方差分析和多個獨立樣本的F檢驗，其中乳酸脫氫酶(LDH)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、總膽紅素(TBIL)、谷酰轉肽酶(GGT)、尿酸(UA)、Ca、P 9個指標指標使用單因素方差分析;谷丙轉氨酶(ALT)、磷酸肌酸激酶(CK)、總蛋白(TP)、谷草轉氨酶(AST)、總膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)、甘油三酯(TG)、球蛋白(GLO)9個指標使用多個獨立樣本的F檢驗。3組豚鼠在ALT、LDH、TP、ALB、GLU、CHO、TBIL、HDL－C、LDL－C、TG、GLO、A/G、K、Na、GGT 15個指標上差異有顯著性(P＜0.05);在CRE、ALP、AST、ALP、Ca、BUN、P、CK、UA等指標上差異無顯著性(P＞0.05)。其中無菌豚鼠和普通豚鼠一在LDH、TP、ALB、GGT、Na 5個指標上與普通豚鼠二差異有顯著性。兩組普通豚鼠在CHO1、TBIL、HDL、LDL、TG 5個指標上與無菌豚鼠差異有顯著性。在GLO、A/G、K 3個指標上3組豚鼠差異均有顯著性。在GLU上，普通豚鼠一和無菌豚鼠及普通豚鼠二差異無顯著性，但是無菌豚鼠和普通豚鼠二差異存在顯著性。在ALT指標上普通豚鼠一與另外兩組上差異有顯著性。

3 討論

3.1 無菌檢測

無菌豚鼠培養(yǎng)過程中的難點是無菌狀態(tài)的保持，為了確保無菌豚鼠不被空氣中的微生物污染，進入隔離器中的任何物品都要進行嚴格的滅菌處理。飼料經過60Co在50 kGy的水平上輻射滅菌:耐高溫的墊料等物品采取121℃40 min進行滅菌。對于不耐高溫的塑料器皿等，則用2%的過氧乙酸充分浸泡，以徹底滅菌。另外，還要定期依據(jù)GB/T14924.1－2001;GB/T14924.2－2001對無菌豚鼠微生物攜帶情況進行檢測，確保培育出的無菌豚鼠質量。

在評價無菌檢測的結果時，檢測樣品數(shù)量與所使用的培養(yǎng)方法有緊密的聯(lián)系，必須按檢測要求嚴格執(zhí)行。另外，無菌檢測時檢測樣品數(shù)量和檢測準確性之間的關系會隨著污染率的變化而變化，微生物的污染會在同一個隔離器內的個體之間迅速傳播，所以為了提高檢測的準確性，必須按一定間隔日期反復進行檢測，以保證實驗動物無菌狀態(tài)的維持。

表2 無菌豚鼠、普通級豚鼠一、二血生化的比較Tab.2 Comparison of blood biochemical parameters between the germ free and conventional guinea pigs(groups 1 and 2)

3.2 無菌豚鼠和普通級豚鼠血常規(guī)的比較

無菌豚鼠在無菌隔離器中生長，溫度、濕度恒定，呼吸經過高效過濾的空氣，人工乳和水經過高壓滅菌，飼料經過60Co照射，免疫系統(tǒng)沒有經受微生物的侵襲，防御功能較低，而白細胞是機體防御系統(tǒng)的一個重要組成部分，所以無菌豚鼠血常規(guī)中白細胞值較低;白細胞分類比較中，五種細胞的數(shù)量和百分比在兩組普通級豚鼠的比較中存在5處差異，均低于普通級豚鼠，這與無菌豚鼠缺乏微生物刺激有關;無菌豚鼠和普通級豚鼠的平均血紅蛋白濃度也存在差異。飼養(yǎng)在隔離器中的普通豚鼠雖然體內帶菌，但是與無菌豚鼠生活環(huán)境的壓力、溫度、濕度相似，所以并沒有出現(xiàn)文獻上報道的血紅蛋白、血小板、紅細胞比容等方面的差異［6］。同時實驗中的兩組豚鼠與相關文獻上報道的普通豚鼠的血生化值作比較發(fā)現(xiàn)在WBC、MCV、MCHC、PLT、MPV上均有一定程度的差異，文獻中的普通豚鼠與實驗中的普通豚鼠在其他指標上無異。這提示溫度、壓力等環(huán)境因素影響動物的血液學參數(shù)［16－18］。

3.3 無菌豚鼠和普通級豚鼠血生化的比較

血液中免疫球蛋白是機體受到抗原刺激后由漿細胞合成，它能與外來的特異性抗原起免疫反應保護機體，無菌豚鼠的免疫系統(tǒng)處于休眠狀態(tài)，沒有接受任何菌群的刺激，所以TP、GLO、ALB均低于飼養(yǎng)在普通環(huán)境的豚鼠，A/G高于飼養(yǎng)在普通環(huán)境的豚鼠。飼養(yǎng)在隔離器中的普通級豚鼠相對于無菌豚鼠和飼養(yǎng)在普通環(huán)境的豚鼠蛋白含量低，但是白蛋白的含量高于無菌豚鼠。飼養(yǎng)在隔離器中的普通級豚鼠體內含有菌群，但由于其生活在隔離環(huán)境中，體內的微生物菌群體系不完整，所以其體內白蛋白的含量低于飼養(yǎng)在普通環(huán)境的普通動物，但是高于無菌動物。無菌豚鼠體內無寄生菌，菌類在脂肪類和糖類物質的代謝方面起了重要的作用。有研究表明，無菌動物體內膽固醇的代謝減慢，在體內難以轉化為可供使用的小分子甾醇［15］。所以高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、膽固醇、甘油三脂及糖在3組豚鼠中也存在差異。血清中的LGH、GGT均在肝臟中產生。文獻中報道的SPF級動物的肝臟臟器系數(shù)較小，免疫功能低下。無菌動物較之SPF級動物免疫功能更低，所以這兩項指標均低于普通豚鼠。同時將實驗中的普通豚鼠二的指標與文獻中報道的正常豚鼠作比較，大部分結果相似，但是有些數(shù)據(jù)與文獻中相差較大，可能與檢測方法和單位有關［17－18］。

實驗證明，微生物環(huán)境因素對實驗動物血液學參數(shù)的影響十分顯著，血液學參數(shù)是機體各組織、器官功能和狀態(tài)的反映，說明寄生微生物對宿主的生理、代謝及機體防御等方面都有顯著影響。無菌動物生活在無菌的隔離環(huán)境中，沒有微生物的影響，無菌動物逐漸適應，其生理生化各方面都有改變，尤其是免疫系統(tǒng)，無菌動物的免疫系統(tǒng)未被激活，這些特征決定了無菌動物有很多普通動物不可替代的應用［14］。如微生物相互作用、人類正常菌群模型和一些感染、免疫模型，對研究一些疾病的病理生理也有著不可替代的作用。但是目前國際上無菌動物的應用還很少，國內更是鮮有人研究。對無菌豚鼠和普通級豚鼠血液學參數(shù)進行測定，為無菌動物在我國醫(yī)學科研中的廣泛應用提供重要的基礎數(shù)據(jù)，兩組數(shù)據(jù)的比較也便于醫(yī)學科技工作者在實驗動物模型的選擇過程中參閱、參考。

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Com parison of Hem atological Param eters in Germ-Free and Conventional Guinea Pigs

ZHANG Kun，SUN Shu－h(huán)ua，ZHANG Hui－min，HU Xiao－yan，WANG Yan－rong，MENG Jin－ping，LIU Yun－bo
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo compare the hematological parameters in germ－free and conventional guinea pigs.MethodsGerm－free guinea pigs were obtained by cesarean section，and the offsprings were fed with artificial milk by hand in the germ free isolator.The gem－free situation was detected at fixed time points by hematology analyzer. Hematological parameters of the germ－free and conventional guinea pigs were compared with SPSS 12.0.ResultsThe germ free guinea pigs showed significant differences in the values of WBC，MO，LY#，MCHC，NE#，EO#and BA#of routine blood cell counts(P＜0.05)in comparison with those of the conventional guinea pigs.There were also significant differences in the values of ALT，LDH，TP，ALB，GLU，CHO，TBIL，HDL－C，LDL－C，TG，GLO，A/G，K，GGT，and Na concentrations between the two groups of guinea pigs(P＜0.05).ConlusionA germ－free guinea pig model has been successfully established by normative cesarean section.There are significant differences in a number of hematological parameters between germ－free and conventional guinea pigs.

Cesarean section;Germ free guinea pig;Routine blood test;Blood biochemical parameters

Q－593

A

1005－4847(2010)02－0176－05

2009－12－18

國家重大疾病基金實驗動物技術平臺(編號:2009ZX10004－402)。

張琨(1985－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:環(huán)境因子生物學效應。E－mail:qiankunkai_8723@163.com

劉云波，研究員。E－mail:liu－yunbo@263.net