樊春筍，黃一波，李雯，舒易來，沈雁

(復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院，上海 200031)

研究報告

分泌性中耳炎大鼠咽鼓管鼓室β－防御素的表達

樊春筍，黃一波，李雯，舒易來，沈雁

(復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院，上海 200031)

目的檢測大鼠β防御素(rat β－defensin，rBD)在分泌性中耳炎大鼠咽鼓管鼓室的表達，探討β防御素在分泌性中耳炎發(fā)病機制中的作用。方法排除中耳感染的清潔級SD大鼠48只，隨機分為4組，前3組36只行頸部切口經(jīng)右側(cè)聽泡注入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)溶液(1 mg/mL)30 μL制作分泌性中耳炎動物模型，造模后分別于第1、3、7天斷頭取咽鼓管鼓室黏膜;對照組12只右側(cè)聽泡注入生理鹽水30 μL，左側(cè)聽泡作為正常組，3 d后斷頭取咽鼓管鼓室黏膜。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT－PCR)檢測咽鼓管鼓室rBD－1 mRNA和rBD－2 mRNA的表達。結(jié)果正常大鼠咽鼓管鼓室存在rBD－1和rBD－2的表達，且rBD－1的表達較rBD－2強，差異有統(tǒng)計學意義;造模后第1、3、7天，rBD－1表達變化不明顯;rBD－2則在造模后第1、3天明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義，第7天漸回復到正常水平。結(jié)論在大鼠，rBD－1可能參與正常咽鼓管鼓室的防御功能，造模后rBD－2的表達增加可能與病原體入侵后的清除相關(guān)。

β－防御素;分泌性中耳炎;大鼠

分泌性中耳炎(otitis media with effusion，OME)是小兒耳鼻咽喉科的常見病，亦是導致兒童傳導性耳聾的最常見原因。OME發(fā)病與細菌等病原體入侵，咽鼓管功能障礙，固有免疫及適應性免疫反應等因素相關(guān)，確切發(fā)病機制至今未完全闡明［1］。

β－防御素屬于固有免疫抗微生物肽(antimicrobial peptides，APs)，是一類富含半胱氨酸的小分子陽離子多肽，體外實驗證實其能夠殺傷包括革蘭陰性和陽性菌、真菌、帶包膜病毒及寄生蟲在內(nèi)的各種病原體［2］。β－防御素各個亞型廣泛表達于哺乳動物呼吸道，包括中耳。在大鼠，目前研究較多的β－防御素主要有兩種，分別為大鼠β防御素－1(rat β－defensin－1，rBD－1)和大鼠β防御素－2(rat β－defensin－2，rBD－2)。

本實驗通過頸部入路聽泡內(nèi)注入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)溶液構(gòu)建分泌性中耳炎大鼠模型，檢測造模前后rBD－1及rBD－2的mRNA表達情況，探討β－防御素在分泌性中耳炎發(fā)病機制中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康清潔級SD大鼠48只，雌性，體質(zhì)量200～250 g之間，購自復旦大學醫(yī)學院實驗動物中心【SCXK(滬)2007－0002】。實驗前所有大鼠在手術(shù)顯微鏡下根據(jù)鼓膜表現(xiàn)排除自發(fā)性中耳炎，實驗期間飼養(yǎng)于復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院實驗動物房，自由飲食。

1.2 造模試劑

LPS(from Escherichia coli 055:B5)，產(chǎn)品號: L2880，規(guī)格10 mg，購自Sigma中國公司，無菌條件下溶于10 m L生理鹽水，每50 μL分裝，－30℃凍存。甲苯噻嗪購買自南京法姆化學廠，20 mg溶解于2 m L生理鹽水中，過濾除菌后與2 mL(0.1 g)氯胺酮針劑混合成大鼠麻醉藥，4℃保存。

1.3 造模過程

首先隨機將48只SD大鼠等分為四組，第一組12只大鼠右耳為生理鹽水對照組，左耳為空白對照組，另外三組共36只大鼠右耳為造模組。

SD大鼠麻醉采用氯胺酮+甲苯噻嗪(100 mg/ kg+20 mg/kg)混合溶液肌注，右頸前下頜下緣平行切口(圖1，彩插6)，結(jié)扎頸淺靜脈(圖2，彩插6)，鈍性分離頸部肌肉(圖3，彩插6)，暴露右側(cè)聽泡(圖4，彩插6)，用自制細鋼針在聽泡鉆兩小孔。造模組共36只大鼠自一孔注入脂多糖溶液30 μL，另一孔用作平衡中耳腔內(nèi)壓力。生理鹽水對照組12只大鼠右側(cè)聽泡則自一孔注入無菌生理鹽水30 μL。注藥后骨蠟封閉小孔，表面覆蓋肌骨膜瓣，5－0可吸收線間斷縫合肌肉，4－0尼龍線縫合皮膚。大鼠自然蘇醒后回動物房飼養(yǎng)，自由飲食。造模后第1、3、7天大鼠斷頭前手術(shù)顯微鏡下觀察鼓膜變化以確定造模成功。

1.4 獲取咽鼓管鼓室黏膜

SD大鼠麻醉(方法同上)后快速斷頭，沿中線切開頭顱，找到咽鼓管鼻咽口，同時剝離聽泡(包括咽鼓管全長)，暴露咽鼓管鼓室口，眼科顯微器械(經(jīng)DEPC水處理)在手術(shù)顯微鏡下快速剝離咽鼓管鼓室黏膜，置入凍存管內(nèi)，投入液氮罐速凍2 h，抽提總RNA前存于－80℃冰箱內(nèi)。

1.5 RT-PCR過程

1.5.1 TRIzol試劑提取咽鼓管鼓室黏膜總RNA:在瓷研缽(經(jīng)DEPC水處理)內(nèi)同時加入液氮和TRIzol，研磨經(jīng)速凍的咽鼓管鼓室黏膜，取兩個黏膜標本同時研磨以保證總RNA質(zhì)量，TRIzol試劑加入量為2 m L。提取總RNA后行瓊脂糖電泳證實其完整性，紫外分光光度計測量RNA含量:A260/A280比值均＞1.8。

1.5.2 逆轉(zhuǎn)錄過程:取模板RNA 1 μg，Oligo dT 4 μL，加DEPC水至11.5 μL，65℃5 m in后冰浴;再加入5×buffer 4 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，10 mmol/ L dNTP m ix 2 μL，莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)2 μL，37℃1 h后，70℃10 m in。

1.5.3 引物設計:GeneID(RBD－1):83687，RBD－1正向引物:GACCCTGACTTCACCGACAT，反向引物: CCTGCAACAGTTGGGCTTAT，產(chǎn)物222 bp;GeneID (RBD－1):64389，RBD－2正向引物:CCTCACCAG GCTTCAGTCA，反向引物:AGTCCACAAGTG CCAATCT，產(chǎn)物179 bp;內(nèi)參為β－actin，正向引物: TTTTGTGCCTTGATAGTTCGC，反向引物:GAGTC CTTCTGACCCATACCC產(chǎn)物:264 bp;引物由上海銳賽生物技術(shù)有限公司代為合成。

1.5.4 PCR擴增:擴增體系為10×buffer 2 μL，MgSO4(50 mmol/L)1 μL，dNTP(10 mmol/L，Takara) 1 μL，正向引物(10 μmol/L)1 μL，反向引物(10 μmol/L)1 μL，模板1 μL，Platinum Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2 μL，dd H2O 12.8 μL。循環(huán)條件: 94℃、3 m in、1個循環(huán);94℃、30 s，58℃、30 s，68℃、30 s，35個循環(huán);68℃、10 m in、1個循環(huán)。

1.5.5 PCR擴增產(chǎn)物半定量:產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖電泳檢測，溴化乙啶染色，紫外燈下觀察實驗結(jié)果，拍照后通過Image J軟件對比電泳條帶灰度，相對含量為rBD－1、rBD－2條帶和內(nèi)參條帶的灰度比值。

1.6 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，正常咽鼓管鼓室黏膜rBD－1和rBD－2之間表達比較采用t檢驗，造模后rBD各亞型在不同時間點的表達比較采用隨機區(qū)組方差分析。統(tǒng)計軟件為STATA 10.0，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果

所有48只SD大鼠在造模過程中均未因麻醉、手術(shù)而死亡。注藥后鼓膜均有明顯中耳炎癥表現(xiàn)，主要征象為鼓膜增厚，由透明變?yōu)榛野咨蜱晟?氣泡及積液征象在注藥后第1、3天較明顯，注藥后第7天基本消退。

2.2 rBD-1和rBD-2基因表達

正常SD大鼠咽鼓管鼓室黏膜rBD－1 mRNA相對表達量為:0.80±0.07，rBD－2 mRNA相對表達量為:0.22±0.02，兩者差異有顯著性(P＜0.01)(見圖5)。造模后第1、3天，rBD－2 mRNA對比造模前表達明顯增加，相對表達量為0.84±0.03，0.81± 0.07，差異有顯著性(P＜0.01)，造模后第7天，rBD－2 mRNA(0.30±0.04)基本回復到正常水平; rBD－1 mRNA在造模前后變化不大，差異無統(tǒng)計學意義(見圖6)。生理鹽水對照組與正常組比較，rBD基因表達無明顯差異。

M:DNA標記物圖5正常SD大鼠和生理鹽水對照組SD大鼠咽鼓管鼓室黏膜rBD－1 mRNA和rBD－2 mRNA的表達M:DNA markerFig.5 Expression of rBD－1 mRNA and rBD－2 mRNA in the tubotympanum mucosa of rats in the normal group and saline control group

M:DNA標記物圖6造模后第1、3、7天SD大鼠咽鼓管鼓室黏膜rBD－1 mRNA和rBD－2 mRNA的表達M:DNA markerFig.6 Expression of rBD－1 mRNA and rBD－2 mRNA in the tubotympanum mucosa of rats with otitis media with effusion at 1－，3－and 7－day after LPS injection

3 討論

2001年Lim等［1］指出中耳炎的發(fā)病有三個必要條件:細菌等病原體附著于鼻咽部;病原體通過咽鼓管進入中耳腔;中耳上皮的物理和固有免疫防御屏障出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能紊亂。中耳上皮(包括咽鼓管)的生理穩(wěn)態(tài)部分由粘蛋白、水通道蛋白、表面活性物質(zhì)及一些抗微生物分子來維持，與OME發(fā)病相關(guān)的抗微生物分子主要包括β防御素，乳鐵蛋白，溶菌酶等幾種。

β防御素廣泛表達于哺乳動物呼吸消化道、泌尿生殖道黏膜上皮，其不同亞型呈現(xiàn)2種表達方式:構(gòu)成性表達(constitutive expression)和誘導性表達(inductive expression)。所謂構(gòu)成性表達即表達較為恒定，一些誘導因素如病原體刺激等不能導致其表達增加;誘導性表達則表現(xiàn)為β防御素在病原體等誘導因素刺激下出現(xiàn)表達或表達上調(diào)。在人類和小鼠，β防御素－1一般呈構(gòu)成性表達，β防御素－2、3等亞型則呈誘導性表達［3］。以往的研究表明，rBD的表達模式和人類及小鼠有所不同，1999年國外學者［4］首次在大鼠鑒定出兩種β防御素，即rBD－1和rBD－2，并發(fā)現(xiàn)其表達呈組織特異性。在大鼠腎臟主要是rBD－1的表達;在大鼠肺，rBD－1主要在支氣管上皮表達，rBD－2則主要在肺泡II型細胞表達。這種與其他哺乳動物表達方式上的差異可能是由于rBD－2在第2、3半胱氨酸殘基之間的氨基酸序列和其他β防御素－2有明顯不同造成。2005年Froy等［5］用RT－PCR方法測量rBD在大鼠腦，腎，肺，脾，肝等主要臟器的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rBD－1在腎，肺，腦有表達，rBD－2在肺、腦、肝表達，并認為大鼠適合作為β防御素相關(guān)研究的模式動物。在本實驗鼓室中，rBD－1 mRNA和rBD－2 mRNA在正常大鼠咽鼓管黏膜均有發(fā)現(xiàn)，并且rBD－1的表達強度明顯高于rBD－2，這提示在正常大鼠，主要是rBD－1參與正常中耳無菌狀態(tài)的維持。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)為革蘭陰性菌內(nèi)毒素的主要成分［6］，屬于病原體相關(guān)分子模式(pathogen－associated molecular patterns，PAMPs)，是導致OME發(fā)病的重要病原因子。LPS已成為最常用的中耳炎動物模型局部誘導物質(zhì)，可以在大小鼠、豚鼠等造成較為穩(wěn)定的中耳炎癥。本實驗采用與國內(nèi)李希平［7］報道的相似方法成功構(gòu)建了OME大鼠模型，炎癥持續(xù)時間大約7d，rBD－2的表達上調(diào)亦在造模后第7天基本回復正常。各種體內(nèi)體外實驗證實LPS可誘導大鼠中耳黏膜多種基因表達上調(diào)，如粘蛋白基因等［8］，這些基因的表達上調(diào)和β防御素一起參與了中耳炎的發(fā)病，粘蛋白在LPS誘導下的表達上調(diào)被認為與其可固定病原體于β防御素高濃度區(qū)域，從而增強β防御素抗菌效力有關(guān)［1］。Jin等［9］用肺炎鏈球菌誘導出小鼠中耳炎模型，造模前，在咽鼓管鼓室只發(fā)現(xiàn)小鼠β防御素－1的表達，造模后則發(fā)現(xiàn)小鼠β防御素－2、3、4表達上調(diào)明顯，小鼠β防御素－1表達上調(diào)則不顯著。國內(nèi)有學者［10］用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)在肺炎鏈球菌誘導的小鼠中耳炎模型中，造模后小鼠咽鼓管管旁腺體中β防御素－2的表達明顯增加，造模后7d表達增加最明顯。這與本實驗的結(jié)果有所不同，本實驗中SD大鼠咽鼓管鼓室rBD－2 mRNA在造模后第1、3天明顯上調(diào)，第7天已基本回復到正常水平，這種差異或許可歸結(jié)于rBD－2與小鼠β防御素不同的表達方式。

LPS誘導β防御素表達或表達上調(diào)被認為大都是通過Toll樣受體(toll－like receptors，TLRs)調(diào)節(jié)。在病原體入侵后，TLR識別病原體表面的PAMPs如LPS，隨后激活胞內(nèi)相關(guān)信號通路，最后導致β－防御素表達或者表達上調(diào)。另外還存在一些不依賴于TLR的信號通路，相關(guān)研究較少［11］。Song等［12］用RT－PCR及Western blot方法證實在大鼠咽鼓管鼓室黏膜有TLR－2及TLR－4的表達，說明rBD－2的表達上調(diào)亦可能是通過TLR相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)。Kurland等［13］發(fā)現(xiàn)大鼠齒齦上皮中rBD－1和rBD－2在放線桿菌刺激下，表達有明顯上調(diào)，而TLR水平則沒有明顯變化，故認為rBD在上皮黏膜的調(diào)節(jié)也可能有其他信號通路存在，這需要進一步的研究證實。

在實驗中發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠咽鼓管鼓室黏膜，存在rBD－1 mRNA的明顯表達，造模后無明顯表達上調(diào);而在正常咽鼓管鼓室黏膜中微弱表達的rBD－2 mRNA在造模后則表達明顯上調(diào)。這可能提示: rBD－1在正常中耳上皮無菌狀態(tài)的維持中起作用，而rBD－2則可能在病原體入侵后起作用，與病原體的清除和后續(xù)的適應性免疫系統(tǒng)激活有關(guān)。需要結(jié)合體外實驗進一步研究rBD表達調(diào)節(jié)的具體信號通路及其和粘蛋白、水通道蛋白及其他抗菌分子的相互作用。

(本文圖1～4見彩插6。)

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Exp ression of β-Defensin in the Tubotym panum in the Rat M odel of O titis M edia w ith Effusion

FAN Chun－sun，HUANG Yi－bo，LI Wen，SHU Yi－lai，SHEN Yan
(ENT Department of EENT Hospital，F(xiàn)uday University，Shanghai 200031，China)

ObjectiveTo compare the expression of β－defensin in normal rat tubotympanum mucosa with that in the rat model of otitis media(OME)with effusion induced by lipopolysaccharide(LPS)，and to clarify the role of innate antimicrobial peptides in the pathogenesis of this disease.M ethods A total of 48 Sprague－Dawley rats(200－250 g)，free of middle ear infection，were used in the current experiment.The bulla was exposed by neck approach.30 μL LPS solution (1 mg/m L)was injected into the right bulla in 36 rats，30 μL physiological saline was injected into the right bulla in another 12 rats(control group)，the left bulla was intact to be normal group.The tubotympanum mucosa was obtained quickly after decapitation in 12 rats of the control group and 36 rats inoculated by LPS at 1，3，7 days(12 rats in each sub－group).Reverse transcription polymerase chain reaction(RT－PCR)was performed to detect the expression of rBD1 mRNA and rBD2 mRNA.ResultsBoth rBD－1 and rBD－2 mRNA were detected in normal rat tubotympanum mucosa and the expression of rBD－1 mRNA was significantly higher than rBD－2(P＜0.01).rBD－2 mRNA increased dramatically in the inflammatory mucosa(P＜0.01)whereas rBD－1 mRNA did not show significant augmentation.The up－regulation of rBD－2 gene was notable in the 1－and 3－day groups and declined to normal in the 7－day group.ConlusionOur findings indicate that rBD－1 may be a part of defense system in the normal rat middle ear，and the induced expression of rBD－2 is related to the clearance of invading pathogens.

β－defensin;Otitis media with effusion;Rat

R764.21

A

1005－4847(2010)04－0322－04

2010－01－15

樊春筍(1979－)，男，在讀碩士，研究方向:小兒耳鼻咽喉科學。

沈雁，主任醫(yī)師，副教授，E－mail:drshenyan@139.com