陳石，張德平

(1.南京市胸科醫(yī)院呼吸科，江蘇南京 210029;2.南京市鼓樓醫(yī)院呼吸科，江蘇南京 210008)

研究報(bào)告

酸吸入致大鼠肺纖維化初步探索

陳石1，張德平2

(1.南京市胸科醫(yī)院呼吸科，江蘇南京 210029;2.南京市鼓樓醫(yī)院呼吸科，江蘇南京 210008)

目的研究實(shí)驗(yàn)性酸吸入與大鼠肺間質(zhì)纖維化的相關(guān)性及其可能的作用機(jī)制，并與傳統(tǒng)的博來(lái)霉素致纖維化作一比較。方法健康雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、博來(lái)霉素組、高濃度鹽酸組、中濃度鹽酸組和低濃度鹽酸組，每組24只。博來(lái)霉素組氣管內(nèi)一次性注入博來(lái)霉素誘導(dǎo)纖維化，鹽酸組每周氣管內(nèi)滴注不同濃度鹽酸1次，正常對(duì)照組每周氣管內(nèi)滴注生理鹽水1次。各組分別于造模后第7、14、28及42天隨機(jī)處死6只，取肺組織行HE、Masson染色評(píng)價(jià)肺組織病理變化，用RT－PCR方法測(cè)定肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF－β1)的mRNA表達(dá)，用免疫組化的方法半定量測(cè)定I型膠原蛋白、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的表達(dá)。結(jié)果鹽酸組肺泡炎程度始終顯著高于對(duì)照組，在開(kāi)始2周內(nèi)達(dá)到一個(gè)高峰，隨后仍舊維持一個(gè)相對(duì)較高狀態(tài)，28 d達(dá)到或者超過(guò)博來(lái)霉素組水平。鹽酸組纖維化程度隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，顯著高于對(duì)照組，但始終未超過(guò)博來(lái)霉素組。鹽酸組肺組織TGF－β1mRNA在28 d時(shí)達(dá)到博來(lái)霉素組水平，至42 d時(shí)全面超過(guò)博來(lái)霉素組水平。博來(lái)霉素組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織I型膠原表達(dá)均顯著高于正常陰性對(duì)照組及3個(gè)鹽酸組。高、中濃度鹽酸組CTGF表達(dá)從14 d起高于正常陰性對(duì)照組，且隨滴注次數(shù)及時(shí)間增加而增強(qiáng)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)從一個(gè)角度反映了經(jīng)常性胃食管酸反流引起的酸吸入與肺纖維化的相關(guān)性，為揭示胃食管反流病(GERD)與特發(fā)性肺纖維化(IPF)的關(guān)系提供了初步的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

肺纖維化;胃食管反流病;鹽酸;博來(lái)霉素

胃食管反流病(GERD)與多種呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)，如慢性咳嗽、哮喘、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征、慢性阻塞性肺疾病［1－5］。但它對(duì)肺部的纖維化及損傷有時(shí)卻被忽略。而近年來(lái)隨著24h食管pH監(jiān)測(cè)儀等先進(jìn)儀器的應(yīng)用，讓人們逐漸認(rèn)識(shí)到胃食管反流可能對(duì)特發(fā)性肺纖維化的影響。從1976年Mays等［6］第一次報(bào)道了臨床上GERD與肺纖維化的相關(guān)性至今，有多篇文獻(xiàn)報(bào)道特發(fā)性肺纖維化(IPF)與GERD的相關(guān)性［7－9］。最近Raghu［10］進(jìn)行了一項(xiàng)類(lèi)似的統(tǒng)計(jì)研究，65名確診為IPF的患者，GERD的發(fā)病率高達(dá)87%。因此人們推測(cè)GERD引起的酸吸入可能與肺纖維化存在某種聯(lián)系［30］。

Popper等［11］報(bào)道了向動(dòng)物氣管內(nèi)滴入酸可以引起動(dòng)物肺損傷及纖維化。在酸性條件下肺泡細(xì)胞可能被酸破壞，使肺表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生減少，加之富含蛋白成分的血漿滲出，可進(jìn)一步加重肺組織損傷及纖維化程度。

但至今尚沒(méi)有一種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從病理、蛋白表達(dá)、mRNA基因水平等多角度揭示實(shí)驗(yàn)酸吸入引起肺纖維化的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)分別用病理切片分析、免疫組化蛋白半定量鑒定、PCR等多種方法，觀察鹽酸(胃酸的主要成分)對(duì)肺部造成的損傷，以及它和肺纖維化之間可能存在的相關(guān)性進(jìn)行研究，探討二者之間聯(lián)系可能的病理生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

博來(lái)霉素A5針劑(天津太河制藥有限公司)、鹽酸(南京化學(xué)試劑有限公司)、半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)試劑、Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)、SuperscriptTMⅢReverse Transcriptase (SuperscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄酶)試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)、Oligo(dT)(美國(guó)Invitrogen公司)、PCR試劑盒(TaKaRa TaqTM，大連寶生物工程有限公司)、鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF－β1)單克隆抗體(美國(guó)R＆D公司)、大鼠CTGF單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，I型膠原單克隆抗體(美國(guó)sigma公司產(chǎn)品)、PV－6000二步法免疫組化試劑盒(北京中衫金橋生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立和分組:健康雄性SD大鼠120只，體重180～200 g，南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供【SCXK(蘇)2005－0002】。隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組(N組)、博來(lái)霉素組(B組)、高濃度鹽酸組(H組)、中濃度鹽酸組(M組)及低濃度鹽酸組(L組)，每組24只。鹽酸臨用前用蒸餾水稀釋成0.2、0.1及0.05 mol/L 3個(gè)濃度組，每周給予3個(gè)鹽酸組氣管內(nèi)滴注1次(2 m L/kg)。正常組每周氣管內(nèi)給予等體積生理鹽水1次。博來(lái)霉素組一次性氣管內(nèi)給予博來(lái)霉素(5 mg/kg)。

1.2.2 取材:各組分別在造模后第7、14、28及42天隨機(jī)處死6只大鼠。氯胺酮腹腔注射麻醉后腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，開(kāi)胸取肺組織，用生理鹽水將肺組織漂洗數(shù)次，右肺上葉經(jīng)4%甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色、Masson三色染色及免疫組織化學(xué)染色。

1.2.3 肺組織病理分析:肺組織經(jīng)不同濃度酒精常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后，分別給予HE和Masson三色染色。根據(jù)Szapiel等［12］的方法評(píng)價(jià)肺泡炎和肺纖維化的程度。肺泡炎分4級(jí):無(wú)肺泡炎(－)，評(píng)0分;輕度肺泡炎(+)，評(píng)1分，表現(xiàn)為單核細(xì)胞浸潤(rùn)使肺泡隔增寬，僅限于局部和近胸膜部，面積小于全肺的20%，肺泡結(jié)構(gòu)正常;中度肺泡炎(++)，評(píng)2分，受累面積占全肺的20%～50%，近胸膜部較重，重度肺泡炎(+++)，評(píng)3分，面積大于50%，偶見(jiàn)肺泡腔內(nèi)有單核細(xì)胞及出血造成實(shí)變。肺纖維化分4級(jí):無(wú)纖維化(－)，評(píng)0分;輕度纖維化(+)，評(píng)1分，受累面積小于20%，纖維化累及胸膜及胸膜下的肺間質(zhì)，肺泡的結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂;中度纖維化(++)，評(píng)2分，病變范圍約占全肺的20%～50%，纖維化區(qū)域從胸膜延伸，仍屬局部性;重度纖維化(+++)，評(píng)3分，病變范圍大于50%，并有融合，可見(jiàn)大小不等的囊氣腔。

1.2.4 肺組織中TGF－β1－mRNA的表達(dá):采用半定量RT－PCR測(cè)定，Trizol法提取肺組織總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下:(1) TGF－β1:上游5′－GCTAATGGTGGACCGCAAC－3′，下游:5′－GCAGTGAGCACTGAAGCGA－3′，目的片段長(zhǎng)度340 bp;(2)β－actin:上游:5′－GAGACCTTCAA CACCCCAGC－3′，下游:5′－CACAGAGTACTTGCGCT CAG－3′，目的基因片段長(zhǎng)度654 bp。PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 μg/m L溴化乙啶)后，凝膠成像及分析系統(tǒng)下掃描分析，用TGF－β1及β－actin擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光度比值表示每個(gè)標(biāo)本的相對(duì)mRNA水平。

1.2.5 肺組織中CTGF與I型膠原的表達(dá)測(cè)定:采用免疫組化EnVision二步法，分別按CTGF與I型膠原檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，

1.2.6 結(jié)果分析:免疫組化結(jié)果以肺組織中出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性顯色，并用Image－pro plus專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)分別對(duì)CTGF與I型膠原的表達(dá)進(jìn)行定量分析，在400倍視野下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)定積分吸光度來(lái)代表CTGF的表達(dá)量，在100倍視野下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)定積分吸光度來(lái)代表I型膠原的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)改變

2.1.1 肺泡炎程度比較:正常陰性對(duì)照組(N組)肺泡壁薄，結(jié)構(gòu)正常，無(wú)特殊改變。博來(lái)霉素陽(yáng)性對(duì)照組(B組)氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素7d后，大鼠肺泡間隔及肺泡內(nèi)即出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，可見(jiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，顯著強(qiáng)于正常陰性對(duì)照組(N組)(P＜0.01);此后隨時(shí)間推移，炎癥細(xì)胞減少，逐漸以纖維化改變?yōu)橹?，可?jiàn)多灶性，大小不等的纖維化區(qū)域。而在3個(gè)鹽酸組肺泡炎癥在開(kāi)始兩周內(nèi)達(dá)到一個(gè)高峰，隨后仍舊維持一個(gè)相對(duì)較高狀態(tài)，自28 d達(dá)到或者超過(guò)博來(lái)霉素陽(yáng)性對(duì)照組(B組)水平。各組肺泡炎程度見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺泡炎評(píng)分結(jié)果(±s)Tab.1 The alveolitis scores in each group of rats(±s)

表1 各組大鼠肺泡炎評(píng)分結(jié)果(±s)Tab.1 The alveolitis scores in each group of rats(±s)

注:與N組比較，★P＜0.01;與L組比較，▲P＜0.05;與H組比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01Note:Compared with the normal group，★P＜0.01;Compared with the group L，▲P＜0.05;compared with the group H，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01

組別(Group)7 d 14 d 28 d 42 d N組(Normal group)0.17±0.41 0.33±0.52 0.17±0.41 0.00±0.00 B組(Bleomycin group)2.17±0.75★▲2.00±0.89★1.17±0.75★◆◆1.00±0.63★◆◆H組(Group H)2.17±0.75★▲2.33±0.52★2.17±0.41★2.00±0.00★M組(Group M)1.50±0.55★1.67±0.52★1.67±0.52★1.50±0.55★L(fēng)組(Group L)1.33±0.82★1.83±0.98★1.50±0.55★◆1.33±0.52★◆

2.1.2 纖維化程度比較:Masson三色染色判斷肺組織纖維化程度，正常陰性對(duì)照組(N組)大鼠肺組織含有少量膠原纖維，未見(jiàn)特殊異常改變。博來(lái)霉素陽(yáng)性對(duì)照組(B組)大鼠早期即出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維化，肺間質(zhì)纖維化逐漸加重，至28d達(dá)到頂峰，后逐漸有所下降。鹽酸組早期纖維化程度低，隨時(shí)間推移和滴注鹽酸次數(shù)的增加，纖維化程度逐漸增強(qiáng)，雖然沒(méi)有達(dá)到博來(lái)霉素陽(yáng)性對(duì)照組的纖維化程度，但顯著強(qiáng)于正常陰性對(duì)照組(P＜0.01)，但3個(gè)鹽酸組的纖維化程度都沒(méi)有超過(guò)博來(lái)霉素陽(yáng)性對(duì)照組。結(jié)果見(jiàn)表2和圖1(彩插8)。

表2 各組大鼠肺纖維化評(píng)分結(jié)果(±s)Tab.2 The pulmonary fibrosis scores of rats in each group(±s)

表2 各組大鼠肺纖維化評(píng)分結(jié)果(±s)Tab.2 The pulmonary fibrosis scores of rats in each group(±s)

注:與N組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01;與B組比較，■P＜0.05;與H組比較，◆P＜0.05Note:Compared with the normal group，★P＜0.05，★★P＜0.01;Compared with the bleomycin group，■P＜0.05;Compared with the group H，◆P＜0.05

組別(Group)7d 14d 28d 42d N組(Normal group)0.00±0.00 0.00±0.00 0.17±0.41 0.33±0.52 B組(Bleomycin group)1.33±0.52★★2.00±0.63★★2.50±0.55★★1.83±0.41★★H組(Group H)0.67±0.52★★■1.00±0.63★★■1.33±0.52★★■1.67±0.52★★M組(Group M)0.67±0.52★★■0.83±0.75★★■1.17±0.41★★■1.50±0.55★★L(fēng)組(Group L)0.50±0.55★■0.67±0.52★■0.83±0.75★★■1.00±0.63★★■◆

2.2 肺組織中TGF-β1m RNA的表達(dá)

博來(lái)霉素陽(yáng)性對(duì)照組(B組)TGF－β1mRNA在7、14 d表達(dá)顯著高于其他各組(P＜0.05)，但表達(dá)水平逐漸下降，至第28天時(shí)與正常陰性對(duì)照組(N組)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。3個(gè)鹽酸組在第7、14天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著低于博來(lái)霉素陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)，自第28天起3個(gè)濃度鹽酸組肺組織TGF－β1 mRNA表達(dá)水平與博來(lái)霉素陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，42 d時(shí)3個(gè)濃度鹽酸組TGF－β1 mRNA表達(dá)水平已經(jīng)高于博來(lái)霉素陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。

表3 大鼠肺組織中TGF－β1mRNA的表達(dá)結(jié)果(±s)Tab.3 The expression of TGF－β1 mRNA in the rat lung tissues(±s)

表3 大鼠肺組織中TGF－β1mRNA的表達(dá)結(jié)果(±s)Tab.3 The expression of TGF－β1 mRNA in the rat lung tissues(±s)

注:與N組比較，*P＜0.05;與B組比較，▲P＜0.05;與H組比較，◆P＜0.05Note:Compared with the normal group，*P＜0.05;Compared with the bleomycin group，▲P＜0.05;Compared with the group H，◆P＜0.05

組別(Group)7d 14d 28d 42d N組(Normal group)0.46±0.12 0.44±0.08 0.43±0.16 0.45±0.10 B組(Bleomycin group)0.86±0.24*0.95±0.18★0.73±0.13*0.47±0.11 H組(Group H)0.62±0.06*▲0.70±0.08*▲0.82±0.11*0.87±0.11*▲M組(Group M)0.58±0.08▲0.62±0.09*▲0.72±0.21*0.79±0.22*▲L組(Group L)0.53±0.11▲0.59±0.16*▲0.63±0.12*◆0.72±0.06*▲

注:Maker:DL2000 marker;B:博來(lái)霉素陽(yáng)性對(duì)照;N:正常對(duì)照組;H:高濃度鹽酸組;M:中濃度鹽酸組; L:低濃度鹽酸組;β－act:內(nèi)參圖2各實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織28 d時(shí)TGF－β1 mRNA的表達(dá)Note:Maker:DL2000 marker;B:Bleomycin group;N:Normal group;H:H igh－dose HCl group;M:Middle－dose HCl group;L:Low－dose HCl group;β－act:Internal standardFig.2 The expression of TGF－β1 mRNA in the rat lung tissues at 28 d

2.3 肺組織CTGF的表達(dá)

CTGF是調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和ECM合成的宿主因子，是TGF－β1促纖維化效應(yīng)的下游介質(zhì)，在肺纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道CTGF蛋白在肺纖維化中表達(dá)顯著增加，與肺間質(zhì)纖維化的程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究表明CTGF在正常陰性對(duì)照組(N組)肺組織均為弱表達(dá)或不表達(dá)。博來(lái)霉素陽(yáng)性對(duì)照組(B組)CTGF的表達(dá)在從7 d開(kāi)始出現(xiàn)升高，14 d達(dá)到高峰，以后出現(xiàn)下降。高、中濃度鹽酸組(H、M組)CTGF表達(dá)隨時(shí)間增加而增強(qiáng)，自42d起與博來(lái)霉素組差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4及圖3(彩插8)。

表4 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肺組織CTGF表達(dá)(A值，±s)Tab.4 The expression of CTGF in rat lung tissue at different time points in each group(A，±s)

表4 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肺組織CTGF表達(dá)(A值，±s)Tab.4 The expression of CTGF in rat lung tissue at different time points in each group(A，±s)

注:與N組比較，*P＜0.05;與B組比較，▲P＜0.05;與H組比較，◆P＜0.05Note:Compared with the normal group，*P＜0.05;Compared with the bleomycin group，▲P＜0.05;Compared with the group H，◆P＜0.05

組別(Group)7 d 14 d 28 d 42 d N組(Normal group)1269.67±427.30 1388.83±200.71 1415.17±376.54 1313.17±434.63 B組(Bleomycin group)3906.83±798.86*4873.67±730.18*3887.17±728.11*3143.17±598.97*H組(Group H)1839.50±473.74▲2233.33±616.78*▲2646.33±861.03*▲3044.00±649.84*M組(Group M)1759.83±270.66▲1784.00±313.46▲2325.83±684.07*▲2739.67±634.44*L組(Group L)1469.50±301.67▲1657.67±314.71▲◆1961.00±320.52▲2408.50±606.19*▲

2.4 肺組織I型膠原的表達(dá)

由于纖維化的肺中過(guò)度的TGF－β1和CTGF的表達(dá)，導(dǎo)致I型和III型膠原的增生，膠原在肺間質(zhì)中沉積，使肺組織基質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂形成纖維化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，博來(lái)霉素陽(yáng)性對(duì)照組(B組)大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織I型膠原表達(dá)均顯著高于正常陰性對(duì)照組(N組)(P＜0.05)，與肺組織病理形態(tài)學(xué)改變相一致;高中低3個(gè)濃度鹽酸組(H、M、L組)各時(shí)間點(diǎn)I型膠原表達(dá)始終低于博來(lái)霉素組(P＜0.05)。中低濃度鹽酸組自28d起I型膠原纖維表達(dá)強(qiáng)于正常陰性對(duì)照組(P＜0.05)，但始終沒(méi)有達(dá)到高濃度鹽酸組及博來(lái)霉素組的I型膠原表達(dá)程度。結(jié)果見(jiàn)表5、圖4(彩插8)。

表5 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肺組織I型膠原表達(dá)(I A值，×103，±s)Tab.5 The expression of collagen type I in the rat lung tissues at different time points in each group(I A，×103，±s)

表5 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肺組織I型膠原表達(dá)(I A值，×103，±s)Tab.5 The expression of collagen type I in the rat lung tissues at different time points in each group(I A，×103，±s)

注:與N組比較，*P＜0.05;與B組比較，▲P＜0.05;與H組比較，◆P＜0.05Note:Compared with the normal group，*P＜0.05;Compared with the bleomycin group，▲P＜0.05;Compared with the group H，◆P＜0.05

組別(Group)7 d 14 d 28 d 42 d N組(Normal group)14.12±5.31 15.51±4.66 14.69±5.86 18.49±4.94 B組(Bleomycin group)39.91±13.73*58.31±21.37*82.99±11.53*79.95±10.97*H組(Group H)21.84±7.24▲37.28±13.67*▲46.72±15.96*▲60.12±10.19*▲M組(Group M)18.65±6.32▲22.63±11.25▲◆33.03±3.67*▲◆40.37±14.89*▲◆L組(Group L)14.20±5.23▲16.80±7.77▲◆28.36±11.22*▲◆36.82±8.79*▲◆

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)反復(fù)多次微量低濃度酸注入，既模擬胃食管反流引起的微量誤吸，又可以觀察酸對(duì)肺纖維化發(fā)生發(fā)展所起的作用以及纖維化程度與酸的濃度的關(guān)聯(lián)性，防止了肺水腫的發(fā)生。通過(guò)觀察7、14、28及42 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肺組病理學(xué)改變、TGF－β1mRNA、TGF－β下游因子CTGF的表達(dá)、I型膠原纖維定量來(lái)了解實(shí)驗(yàn)性酸吸入對(duì)肺組織的真正影響。

博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型雖然無(wú)法完全模擬人類(lèi)IPF的慢性纖維化進(jìn)展過(guò)程［13］，但由于目前尚無(wú)更好的動(dòng)物模型，仍是目前公認(rèn)的和人類(lèi)肺間質(zhì)纖維化最相似的動(dòng)物模型［14－15］。因此本實(shí)驗(yàn)選用博來(lái)霉素造模作為陽(yáng)性對(duì)照組，生理鹽水組作為陰性對(duì)照組，與3個(gè)不同濃度的鹽酸組進(jìn)行比較。

肺組織病理結(jié)果顯示，正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)正常，而博來(lái)霉素組大鼠早期即出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維化，后期隨時(shí)間推移有所下降，與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符［16］。而3個(gè)鹽酸組的肺泡炎呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，從28 d起全面超過(guò)博來(lái)霉素組。這表明3個(gè)鹽酸組的肺泡炎從范圍和程度上不斷增加。并隨時(shí)間推移和滴注鹽酸次數(shù)的增加，纖維化程度逐漸增強(qiáng)。

在參與肺纖維化的細(xì)胞因子中，TGF－β是作用最為關(guān)鍵的細(xì)胞因子［17］。其中TGF－β1與肺纖維化關(guān)系最為密切，在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。CTGF是調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和ECM合成的宿主因子，是TGF－β1促纖維化效應(yīng)的下游介質(zhì)。文獻(xiàn)報(bào)道［18］CTGF蛋白在肺纖維化中表達(dá)顯著增加，與TGF－β1、I型膠原蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)濃度鹽酸組肺組織TGF－β1mRNA表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，且有逐漸增加的趨勢(shì)，至第28天和博來(lái)霉素組無(wú)顯著性差異，CTGF表達(dá)規(guī)律也與此類(lèi)似，這充分說(shuō)明鹽酸對(duì)纖維化形成有一定的促進(jìn)作用，可以從基因水平上調(diào)肺組織內(nèi)的TGF－β1及其下游介質(zhì)CTGF蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)肺纖維化發(fā)生發(fā)展。

由于TGF－β1和CTGF的表達(dá)增加，導(dǎo)致I型膠原的增生［19］，膠原在肺間質(zhì)中沉積，使肺組織基質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂形成纖維化［20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高中低3個(gè)濃度鹽酸組各時(shí)間點(diǎn)I型膠原表達(dá)都未達(dá)到博來(lái)霉素組水平。但都有表達(dá)增加，體現(xiàn)了反復(fù)酸吸入致纖維化并逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微量酸造成的纖維化速度較為緩慢，但由于反復(fù)不斷的鹽酸滴注刺激引起異常及過(guò)度修復(fù)，使纖維化進(jìn)程呈進(jìn)行性加重，可能比博來(lái)霉素更好的模擬肺纖維化的病程，更加符合生理學(xué)演進(jìn)和疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

由于實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)周期限制，雖然鹽酸組的纖維化程度得到體現(xiàn)，但實(shí)驗(yàn)性酸吸入的濃度、頻率與天然的胃酸濃度以及GERD胃食管反流的頻率尚存在差距。同時(shí)，還應(yīng)該認(rèn)識(shí)到:肺纖維化的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，多種因素的參與并相互作用，還需要用各種手段監(jiān)測(cè)更多的相關(guān)因子來(lái)觀察酸對(duì)大鼠肺部的具體作用及其與纖維化之間的關(guān)系。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)性酸吸入可導(dǎo)致肺纖維化。本實(shí)驗(yàn)從一個(gè)角度反映了經(jīng)常性胃食管酸反流引起的酸吸入與肺纖維化的相關(guān)性，雖然并不能完全模擬重建胃食管反流引起酸吸入對(duì)肺部的真正影響，但通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以更好地為揭示人類(lèi)GERD與IPF的關(guān)系提供了初步的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

(本文圖1、3、4見(jiàn)彩插8。)

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Correlation of Experim ental Acid Aspiration and Pulm onary Fibrosis in Rats

CHEN Shi1，ZHANG De－ping2
(1.Nanjing Chest Hospital，Nanjing 210029，China;2.The Affiliated Drum Tower Hospital，Nanjing University Medical College.Nanjing 210008)

ObjectiveTo study the pathology and possible mechanism of experimental hydrochloric acid(HCl) inhalation induced pulmonary fibrosis in rats and make a comparison with traditional bleomycin－induced fibrosis.M ethods 120 male SD rats were random ly divided into nomal control group，bleomycin group，high－dose HCl group，middle－dose HCl group and low－dose HCl group.The bleomycin group was intratracheally injected bleomycin once to induce pulmonary fibrosis.The three HCl groups were intratracheally injected HCl once per week.The control group was given saline in the same way.Six rats of each group were random ly sacrificed on day 7，14，28 and 42，respectively.The histological changes of the lung tissue were evaluated by HE and Masson's trichrome staining.The mRNA expression of transforming growth factor－β1(TGF－β1)was assayed by RT－PCR，and the CTGF and collagen type I protein expressions were analyzed by immunohistochemistry.ResultsThe hydrochloride group had a significantly higher extent of alveolitis(P＜0.01)，reaching a peak at the first 2 weeks，and then still maintained at a relatively high status，and from 28 d to reach or exceed that in the bleomycin group.Hydrochloric acid group fibrosis gradually increases over time，significantly higher(P＜0.01 or 0.05)，but not consistently exceeded that in the bleomycin group(P＞0.05).Similar results appeared in the TGF－β1mRNA，I－collagen and CTGF expression in immunohistochemical assessment.ConlusionThe results of this studyindicate from the point of view a relationship between recurrent gastro－esophageal acid reflux caused by acid inhalation and pulmonary fibrosis，and provides preliminary experimental evidence for the relationship between gastroesophageal reflux disease(GERD)and idiopathic pulmonary fibrosis(IPF).

Pulmonary fibrosis;GERD;Hydrochloric acid;bleomycin;Rat

R－33

A

1005－4847(2010)04－0335－06

2009－09－27

江蘇省醫(yī)學(xué)135重點(diǎn)人才資助項(xiàng)目(編號(hào):RC2001005)。

陳石(1981－)，男，研究方向:間質(zhì)性肺病。E－mail:cshonest1981@sina.com

張徳平，E－mail:dpzhang207@yahoo.com.cn