曹君，陳平，楊悅，歐陽(yáng)若蕓，彭紅

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，長(zhǎng)沙 410011)

研究報(bào)告

煙霧暴露所致肺氣腫小鼠模型的建立與評(píng)價(jià)

曹君，陳平，楊悅，歐陽(yáng)若蕓，彭紅

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，長(zhǎng)沙 410011)

目的探討單純煙霧暴露所致肺氣腫小鼠模型建立及病理學(xué)、氣道炎癥及肺功能評(píng)價(jià)，并進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)技術(shù)的改進(jìn)。方法20只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照及煙霧暴露組，煙霧暴露90 d并觀察30 d后行小鼠肺功能檢查、應(yīng)用改進(jìn)方法留取BALF行細(xì)胞計(jì)數(shù)及行肺組織病理切片觀察，并與正常對(duì)照組進(jìn)行比較。結(jié)果煙霧暴露組小鼠氣道阻力(Raw)較正常對(duì)照組增高，動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性(Cdyn)降低;BALF中細(xì)胞總數(shù)高于正常對(duì)照組，巨噬細(xì)胞數(shù)(AM)、中性粒細(xì)胞數(shù)(N)、中性粒細(xì)胞所占比例(N%)也高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;病理學(xué)觀察示煙霧暴露組肺泡腔擴(kuò)大、部分肺泡間隔斷裂、肺泡腔融合、肺氣腫形成，氣道上皮排列紊亂、部分氣道上皮增生、周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并伴有平滑肌增生;形態(tài)學(xué)計(jì)量分析示煙霧暴露組平均內(nèi)襯間隔(MLI)及肺泡破壞指數(shù)(DI)較正常對(duì)照組增加。應(yīng)用改進(jìn)技術(shù)行BAL成功率100%，回收率高達(dá)90%。結(jié)論單純煙霧暴露可以成功建立小鼠肺氣腫模型且穩(wěn)定可靠，與人類慢性阻塞性肺病相似性好，經(jīng)BAL技術(shù)改進(jìn)后該模型可行性高。

慢性阻塞性肺疾病;肺氣腫;香煙煙霧;動(dòng)物模型;支氣管肺泡灌洗

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)由于其患病人數(shù)多，死亡率高，社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題［1］。阻塞性肺氣腫(簡(jiǎn)稱肺氣腫)是COPD的主要病理表現(xiàn)。COPD是一種慢性進(jìn)展性疾病，對(duì)人體進(jìn)行直接研究無論是在技術(shù)上還是在道德倫理上均受限，故動(dòng)物模型的建立及研究顯得十分重要。目前國(guó)內(nèi)已有多人采用單純煙霧暴露成功復(fù)制肺氣腫大鼠模型［2，3］，而關(guān)于小鼠肺氣腫模型建立研究很少，但國(guó)外小鼠肺氣腫模型應(yīng)用廣泛，考慮小鼠個(gè)體小、干預(yù)及取材等操作存在難度限制其在國(guó)內(nèi)研究中推廣。小鼠有易于飼養(yǎng)，繁殖能力強(qiáng)及實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn);且與人類同源性高，是一種很好的研究人類疾病的動(dòng)物模型。支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)是COPD動(dòng)物模型研究中重要部分，獲取的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)可通過計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞、檢測(cè)細(xì)胞因子水平等反映肺局部病理及生理變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

芙蓉牌香煙(焦油13毫克/支，湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司)，Carl Zeiss Axioskop 40光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司)，靜脈留置針(直型，22G，威海潔瑞醫(yī)用制品有限公司)，PLY3211小動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Buxco Electronics公司)。

1.2 動(dòng)物分組

6周齡SPF級(jí)近交系C57BL/6J雄性小鼠20只，體重18～20 g，來源于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(滬)2007－0005】，于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔房飼養(yǎng)，溫度21～23℃，濕度50%～60%，晝夜12 h節(jié)律，自由進(jìn)食、飲水。小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組及煙霧暴露組，每組10只。實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.3 肺氣腫模型建立

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周后開始造模。采用自制的有機(jī)玻璃箱(69 cm×47 cm×38 cm)，玻璃箱1/2高度處置有機(jī)玻璃隔板(隔板上有直徑1 cm圓形通風(fēng)孔，排布密度:1個(gè)/6 cm2)將玻璃箱分為上下兩部分，有機(jī)玻璃箱頂及四側(cè)面下1/2均有圓形通氣孔(箱頂:1個(gè)/100 cm2;側(cè)面下1/2:1個(gè)/250 cm2)。將10只C57BL/6J小鼠置于隔板上，于玻璃箱下1/ 2空間內(nèi)點(diǎn)燃6只香煙，至香煙燃燒完全、煙霧基本消失，約15 m in;掀開箱蓋，休息5 m in，重復(fù)一次煙霧暴露。每日兩次上述煙霧暴露，連續(xù)90 d，停止煙霧暴露后觀察30 d。正常對(duì)照組小鼠亦同時(shí)放入另一自制有機(jī)玻璃箱中，呼吸空氣。為初步觀察煙霧暴露過程中肺病理變化，在煙霧暴露過程中第30天及90 d分別隨機(jī)抽取正常對(duì)照及煙霧暴露組各一只小鼠行肺病理檢查。

1.4 小鼠肺功能檢測(cè)

煙霧暴露停止30 d，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉小鼠，固定，備皮、消毒后，剪開皮膚，輕柔鈍性分離暴露氣管，在氣管軟骨環(huán)之間水平剪開氣管，插入導(dǎo)管并連接小動(dòng)物肺功能儀進(jìn)行肺功能測(cè)定，記錄氣道阻力(Raw)、動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性(Cdyn)及呼氣峰流速(PEF)等指標(biāo)。描記一段平靜呼吸后，于呼氣末自接口處快速注入1.0 m L空氣，使小鼠被動(dòng)的深吸氣，記錄數(shù)據(jù)。小鼠肺功能檢測(cè)在中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，為保證肺功能數(shù)據(jù)質(zhì)量，操作均由同一人進(jìn)行。

1.5 支氣管肺泡灌洗液的收集及計(jì)數(shù)

肺功能測(cè)定后頸椎脫臼處死小鼠，打開左側(cè)胸腔，沿肺葉向上分離結(jié)扎左主支氣管;自氣管切開處置入22G靜脈留置針套管并結(jié)扎氣管，靜脈留置針尾接1m L注射器針筒，較快速度注入無菌PBS 0.5 m L行單側(cè)BAL，注入PBS后立即緩慢低負(fù)壓回收液體，重復(fù)灌洗三次，回收率90%～92%。收集的BALF混勻后吸取20 μL于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上行細(xì)胞計(jì)數(shù);余BALF于4℃1000 r/m in分離心10 min，取沉淀重懸于PBS液并制作3張細(xì)胞涂片，W right－Giemsa染色作細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.6 小鼠肺組織病理學(xué)觀察及形態(tài)定量分析

結(jié)扎右側(cè)主支氣管及左上肺支氣管并注入4%多聚甲醛至左下肺膨脹，隨后將左下肺浸入4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片，常規(guī)蘇木素－伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察HE染色。平均內(nèi)襯間隔(mean linear intercept，MLI)測(cè)定:每只小鼠取3個(gè)HE染色切片，低倍鏡(×100)下隨機(jī)取5個(gè)視野(避開大血管和支氣管)，在每個(gè)視野正中心劃十字交叉線，計(jì)數(shù)與交叉線相交的肺泡隔數(shù)(NS)，同時(shí)測(cè)出十字線總長(zhǎng)(L)，按公式計(jì)算:MLI=L/NS，以表示肺泡平均內(nèi)徑。肺泡破壞指數(shù)(Destructive index，DI)的測(cè)定參照陳燕等［4］方法進(jìn)行:每只小鼠取3個(gè)HE染色切片，每張切片低倍鏡(×100)下至少觀察20個(gè)非重復(fù)視野，分別以正常(N)或破壞(D)記錄肺泡結(jié)構(gòu)的破壞情況，要求每一例各切片的N、D值總和≥3000，以公式計(jì)算DI=D/(D+N)×100。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況觀察

兩組小鼠在實(shí)驗(yàn)前外觀、對(duì)刺激的反應(yīng)及體重均無明顯差異。實(shí)驗(yàn)中煙霧暴露組小鼠在早期表現(xiàn)燥狂不安，隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)而轉(zhuǎn)為安靜。在煙霧暴露后期，小鼠出現(xiàn)進(jìn)食減少，行動(dòng)遲緩，毛發(fā)干澀無光澤。煙霧暴露過程中無小鼠死亡。正常對(duì)照組小鼠飲食正常，活動(dòng)靈敏，皮毛有光澤。

A:正常對(duì)照組B:煙霧暴露組C:肺功能流量－時(shí)間曲線圖解圖1小鼠肺功能流量－時(shí)間曲線(flow－time curve)變化A.Control group B.CS－exposed group C.Explanation of flow－time curve Fig.1 Flow－time curve of pulmonary function in mice

2.2 小鼠肺功能檢測(cè)

肺功能流量－時(shí)間曲線(圖1－C)下半部分為吸氣相，上半部分為呼氣相。與正常對(duì)照組相比(圖1－A)，煙霧暴露組(圖1－B)流量－時(shí)間曲線的上半部分上升支較陡直、而下降支斜度較小且伴有頓挫，呼氣相延長(zhǎng)。煙霧暴露組小鼠Raw較正常對(duì)照組增高明顯，Cdyn較正常對(duì)照組低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05);煙霧暴露組呼氣峰流速(PEF)較正常對(duì)照組稍低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 兩組小鼠肺功能結(jié)果比較(±s，n=8)Tab.1 Comparison of pulmonary function between CS－exposed group and control group(±s，n=8)

表1 兩組小鼠肺功能結(jié)果比較(±s，n=8)Tab.1 Comparison of pulmonary function between CS－exposed group and control group(±s，n=8)

注:*與正常對(duì)照組比較，P＜0.05Note:*P＜0.05 vs.control group

分組Group氣道阻力Airway resistance，kPa/(L·S)動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性Dynamic lung compliance (L/kPa)呼氣峰流速Peak expiratory flow rate，(mL/S)正常對(duì)照組(Control group)0.0365±0.020 0.3100±0.1367 8.38±1.08煙霧暴露組(CS－exposed group) 0.3179±0.097*0.1019±0.0004*7.20±0.97

2.3 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類

應(yīng)用改進(jìn)方法BALA回收率高達(dá)90%以上，正常對(duì)照組及煙霧暴露組BALF回收率分別為(91.3 ±1.0)%、(90.5±1.3)%，兩組BALF回收量及回收率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。煙霧暴露組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)高于對(duì)照組，巨噬細(xì)胞數(shù)(AM)、中性粒細(xì)胞數(shù)(N)、中性粒細(xì)胞所占比例(N%)也高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。見表2。

表2 小鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類結(jié)果比較(±s，n=8)Tab.2 Comparison of cell counts and classification in BALF between CS－exposed group and control group(±s，n=8)

表2 小鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類結(jié)果比較(±s，n=8)Tab.2 Comparison of cell counts and classification in BALF between CS－exposed group and control group(±s，n=8)

注:*與正常對(duì)照組比較，P＜0.05Note:*P＜0.05 vs.control group

組別Group細(xì)胞總數(shù)Total cells(×108/L)巨噬細(xì)胞Macrophages (×108/L)巨噬細(xì)胞百分比Macrophage(%)中性粒細(xì)胞neutrophils (×107/L)中性粒細(xì)胞百分比neutrophil(%)正常對(duì)照組(Control group)1.47±0.24 1.34±0.14 87±9 0.77±0.09 8.7±1.0煙霧暴露組(CS－exposed group)5.85±0.67*4.45±0.63*76±8 7.76±0.92*13.7±2.4*

2.4 小鼠肺組織病理學(xué)改變及形態(tài)定量分析

正常對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)肺組織病理無明顯變化。與正常對(duì)照組小鼠比較(圖2－A)，煙霧暴露30 d時(shí)小鼠肺組織可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、部分肺泡腔輕度擴(kuò)大(圖2－B);至第90天時(shí)出現(xiàn)明顯肺泡腔擴(kuò)大、肺泡壁變薄、肺泡間隔破裂及肺泡腔融合，肺氣腫形成(圖2－C);停止煙霧暴露30 d，亦可見明顯肺泡腔擴(kuò)大及融合(圖2－D)。停止煙霧暴露30 d，比較正常對(duì)照組及煙霧暴露組平均內(nèi)襯間隔(MLI)及肺泡破壞指數(shù)(DI)，可見煙霧暴露組小鼠肺組織MLI及DI均較正常對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。見表3。圖2見彩插2。

表3 小鼠肺組織MLI、DI結(jié)果(±s，n=8)Tab.3 The results of MLI and DI in mice(±s，n=8)

表3 小鼠肺組織MLI、DI結(jié)果(±s，n=8)Tab.3 The results of MLI and DI in mice(±s，n=8)

注:*與正常對(duì)照組比較，P＜0.05;MLI為平均內(nèi)襯間隔;DI為肺泡破壞指數(shù)Note:*P＜0.05 vs.control group.

組別Group MLI Mean linear intercept(μm) DI Destructive index(%)正常對(duì)照組(Control group)33±3 13±3煙霧暴露組(CS－exposed group)52±7*39±4*

觀察兩組小氣道病理表現(xiàn)，可見正常對(duì)照組小鼠氣道壁結(jié)構(gòu)清楚，氣道上皮排列整齊，未見明顯上皮脫落(圖3－A)。而煙霧暴露組小鼠氣道上皮排列紊亂、部分脫落、局部氣道上皮增生(箭頭E所示)、管壁增厚、管腔變小;氣道周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(箭頭I所示)、部分氣道周圍肺泡等支撐結(jié)構(gòu)缺失(箭頭S所示)并伴有局部平滑肌增生(箭頭SM所示)(圖3－B，圖3－C)。圖3見彩插2。

3 討論

COPD是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其發(fā)病率及病死率呈逐年上升的趨勢(shì)。COPD發(fā)病機(jī)制不明，缺乏有效治療方法，許多學(xué)者紛紛通過COPD動(dòng)物模型的構(gòu)建和研究，以進(jìn)一步闡明COPD發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療途徑。對(duì)于肺氣腫模型的建立成功與否，國(guó)內(nèi)學(xué)者鄭鴻翱［5］提出一個(gè)符合臨床實(shí)際的理想COPD動(dòng)物模型應(yīng)滿足以下條件:(1)致傷因素與臨床COPD常見誘因基本一致;(2)必須有氣流阻塞存在，小氣道阻力增高，Cdyn下降; (3)氣道重塑/建;(4)可伴有氣道高反應(yīng)性。該標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合肺組織病理改變可以比較客觀評(píng)價(jià)COPD動(dòng)物模型。

長(zhǎng)期吸煙是導(dǎo)致人類小葉中央型肺氣腫的主要誘發(fā)因素，且煙霧暴露法較急性傷害性模型能模擬人長(zhǎng)期吸煙引起的慢性發(fā)病過程，因此煙霧暴露誘發(fā)的動(dòng)物模型的研究已成為肺氣腫研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。我們既往研究［6，7］采用煙霧暴露成功建立COPD大鼠模型，并證實(shí)吸煙可致SD大鼠肺內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及蛋白酶/抗蛋白酶失調(diào)，但個(gè)體間存在一定的差異，造模過程中有4只大鼠死亡。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于煙霧暴露所致肺氣腫小鼠模型研究十分少見。國(guó)內(nèi)煙霧暴露所致肺氣腫模型大多采用SD及W istar大鼠，均屬封閉群，個(gè)體間遺傳性差異較大，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性差，且SD大鼠對(duì)煙霧刺激及呼吸系統(tǒng)疾病有較強(qiáng)的抵抗;但采用近交系大鼠則實(shí)驗(yàn)成本較高。而小鼠作為一種常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有價(jià)格便宜、繁殖和發(fā)育速度快、生理上個(gè)體差異較少等優(yōu)點(diǎn)。此外，小鼠生物進(jìn)化上與人類非常接近，其組織器官結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能與人相似，人類99%的基因存在于小鼠，93%的小鼠區(qū)域基因排列順序與人類相同，小鼠的許多疾病模型與人類同種疾病有著較高的可比性。且本研究采用的C57BL/ 6J小鼠為標(biāo)準(zhǔn)的近交系小鼠，個(gè)體差異很小，模型可重復(fù)性好，在國(guó)外廣泛應(yīng)用于肺部及其他疾病動(dòng)物模型的研究中。

March等［8］研究發(fā)現(xiàn)就吸煙誘導(dǎo)的肺氣腫而言，B6C3F1小鼠較F344大鼠更敏感。Nikula等［9］研究表明吸煙所致小鼠模型是一種可靠的肺氣腫動(dòng)物模型。Yao等［10］通過煙霧刺激C57BL/6J、A/J、AKR/J、CD－1及129SvJ五種不同品系小鼠，發(fā)現(xiàn)C57BL/6J小鼠對(duì)煙霧刺激高度敏感。Valenca等［11］將C57BL/6小鼠暴露于香煙煙霧中，3支香煙/次，3次/日，60 d后觀察肺病理可見肺氣腫樣改變，伴肺泡巨噬細(xì)胞增多、細(xì)胞外基質(zhì)改變及MMP－12表達(dá)增加。Van der Strate等［12］研究采用C57BL/ 6J小鼠，對(duì)鼻噴煙，2次/日，2支/次，10噴/支，每周5 d，發(fā)現(xiàn)小鼠煙熏至4個(gè)月后發(fā)生氣腔擴(kuò)大，并隨熏煙時(shí)間增加而增加;同時(shí)煙熏小鼠肺組織有與人類肺氣腫相似的隨肺氣腫進(jìn)行性增加的B淋巴細(xì)胞濾泡。由此可見，煙霧暴露所致肺氣腫C57BL/6J小鼠肺內(nèi)存在與人類相似的病理生理改變，但上述研究均未對(duì)煙霧暴露停止后肺病理變化進(jìn)行觀察，且較少應(yīng)用肺功能對(duì)模型可靠性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本研究采用自制煙霧暴露箱對(duì)C57BL/6J小鼠進(jìn)行全身香煙煙霧暴露，6支/次，4次/日，連續(xù)90 d，建立肺氣腫小鼠模型，造模時(shí)間與國(guó)外研究［11，12］不一致，考慮與香煙種類、煙霧暴露方式、煙霧濃度、暴露時(shí)間及暴露頻度有關(guān)。在造模過程無小鼠死亡，說明該方法安全性好。

肺功能是評(píng)價(jià)肺氣腫模型建立的重要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一，本研究采用國(guó)際公認(rèn)的BUXCO小動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)，該設(shè)備技術(shù)先進(jìn)、檢測(cè)精確、數(shù)據(jù)可靠，國(guó)內(nèi)僅有為數(shù)不多的幾家大型科研單位擁有該設(shè)備。同時(shí)在檢測(cè)過程中嚴(yán)格控制操作統(tǒng)一性，保證肺功能的結(jié)果可靠性。肺功能檢查顯示煙霧暴露組小鼠流量－時(shí)間曲線的呼氣部分曲線上升支陡直，提示肺組織彈性較差;而后下降緩慢并伴有頓挫，呼氣相延長(zhǎng)提示小氣道存在阻塞，呼出氣流不暢。進(jìn)一步肺功能數(shù)據(jù)分析顯示:煙霧暴露組小鼠Raw明顯增高，Cdyn明顯下降，提示氣道阻塞、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性下降，與COPD病理生理變化特點(diǎn)相符合。

BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類是反映氣道炎癥的一個(gè)重要指標(biāo)，本研究中行單側(cè)BAL結(jié)果示煙霧暴露組小鼠BALF中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞均增加，且以中性粒細(xì)胞增加為主，提示煙霧暴露可致肺局部炎癥細(xì)胞的聚集，繼而活化釋放一系列炎癥因子、趨化因子、氧自由基與蛋白酶等，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及蛋白酶/抗蛋白酶失衡等一系列病理生理過程，參與肺氣腫形成。

本研究亦初步觀察了兩組不同時(shí)間點(diǎn)肺組織病理改變，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組小鼠各時(shí)間點(diǎn)肺部病理表現(xiàn)未見明顯差異，無自發(fā)性肺氣腫形成，與進(jìn)一步論證該小鼠用于建立實(shí)驗(yàn)性肺氣腫模型的可行性。而煙霧暴露組煙霧暴露第30天時(shí)小鼠肺組織即有局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及部分肺泡腔擴(kuò)大;繼續(xù)暴露至第90天時(shí)可見典型的肺氣腫病理改變。停止煙霧暴露并觀察30 d，發(fā)現(xiàn)小鼠肺組織肺氣腫程度未見減輕，似乎有進(jìn)展趨勢(shì)，提示所建肺氣腫模型穩(wěn)定性好且與人類COPD戒煙后肺損害持續(xù)進(jìn)展的病程規(guī)律相符。而對(duì)于肺氣腫動(dòng)物模型小氣道的觀察，國(guó)內(nèi)研究報(bào)道少，我們的研究發(fā)現(xiàn)煙霧暴露組氣道上皮排列紊亂、局部上皮增生、氣道周圍炎癥浸潤(rùn)、支撐結(jié)構(gòu)缺失及平滑肌增生，提示煙霧暴露組存在氣道重塑，與人類COPD表現(xiàn)一致。

上述肺功能、氣道炎癥及病理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)證實(shí)該C57BL/6J小鼠肺氣腫模型建立成功，符合人類COPD改變，且穩(wěn)定性較好。

小鼠體積小，氣管及支氣管亦較細(xì)小且柔軟，使用注射器法行BAL時(shí)極易損傷而致漏液及灌洗失敗，影響進(jìn)一步的研究。本研究組采用普通靜脈留置針行灌洗術(shù)，成功率高。具體做法是:輕柔暴露氣管后，絲線置于氣管下備用，持靜脈留置針自氣管上段穿刺成功后退金屬內(nèi)芯并將塑料套管緩慢送入氣管約0.4～0.8 cm，結(jié)扎氣管，拔出金屬內(nèi)芯，留置針尾接1.0 m L注射器針筒行BAL，行BAL時(shí)回抽負(fù)壓應(yīng)盡量小，以有液體緩緩流出為宜，同時(shí)可適當(dāng)改變動(dòng)物體位以利于回收液體。而行單側(cè)BAL時(shí)，可采用先從胸側(cè)壁打開一側(cè)胸腔沿肺葉向上尋找該側(cè)主支氣管并予結(jié)扎，自氣管處置靜脈留置針行對(duì)側(cè)BAL，操作簡(jiǎn)單，無需完整分離雙肺及主支氣管。該方法損傷小，操作簡(jiǎn)單，灌洗成功率100%，回收率高達(dá)90%～92%;但該方法使用的直型靜脈留置針成本較普通注射器高，不可高壓消毒以重復(fù)利用，如實(shí)驗(yàn)不要求無菌則可清洗干凈后重復(fù)使用。

本研究結(jié)果顯示，煙霧暴露90 d可致C57BL/6J小鼠肺泡壁變薄、肺泡間隔破裂、肺泡腔擴(kuò)大及融合、肺氣腫形成，停止煙霧暴露后肺部病理改變不會(huì)減輕，且肺功能及氣道炎癥指標(biāo)均證實(shí)模型的建立成功。本研究建立的煙霧暴露所致C57BL/6J小鼠肺氣腫模型能較好地模擬人類COPD病理生理改變、慢性發(fā)病及進(jìn)展的病程規(guī)律。該建模方法安全、經(jīng)濟(jì)、可靠且穩(wěn)定性好，為進(jìn)一步研究研究COPD的發(fā)病機(jī)制及尋找有效治療方法提供了一個(gè)非常好途徑。

(本文圖2，3見彩插2。)

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Establishm ent and Assessm ent of a M ouse M odel of Cigarette Sm oke-Induced Em physem a

CAO Jun，CHEN Ping，YANG Yue，OUYANG Ruo－yun，PENG Hong
(Department of Respiratory Medicine，the Second XiangYa Hospital of Central South University，Changsha 410011，China)

Objective To set and evaluate a mouse model of cigarette smoke(CS)－induced emphysema and improve the method of bronchoalveolar lavage(BAL).M ethods Adult(n=10，18～20 g body wt)male C57BL/6J mice(CS－exposed group)were exposed 4 times per day，whole body，to CS from six cigarettes for consecutive 90 days and then to observe for another 30 days.The control group(n=10)was sham－smoked.An improved method of bronchoalveolar lavage was used and the data of pulmonary function，bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and morphological manifestations were collected.Results Compared with the control group，the CS－exposed group owned higher airway resistance(Raw)，lower dynamic lung compliance(Cdyn)，more macrophages and neutrophils in BALF(all P＜0.05).Morphological detection showed significant enlarged airspace，disruption of alveolar septa and formation of emphysema.After using the improved method，success rate of BAL reached to 100%，and recovery rate was up to 90%.ConlusionCigarette smoke can induce emphysema stably in mice and this mouse model shows high similarity to human chronic obstructive pulmonary disease and is easy to manipulate after methodologic improvement.

Chronic obstructive pulmonary disease;Emphysema;Cigarette smoke;Animal model; Bronchoalveolar lavage

R－563.3，R－332

A

1005－4847(2010)04－0278－05

2009－12－18

國(guó)家科學(xué)自然基金資助項(xiàng)目(編號(hào):30770931，30800503);湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):09JJ3036，07JJ3037)。

曹君(1983－)，女，中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院呼吸內(nèi)科在讀博士生，主要研究方向:慢性阻塞性肺疾病發(fā)病機(jī)制，Email:path_cj71@ yahoo.com.cn

陳平，E－mail:chenping101@hotmail.com，Tel:13873115563