譚瑩，黃萍，操紅纓，陳秋鈴，吳清和

(1.云南省藥物研究所藥物安全性評(píng)價(jià)中心，昆明 650111; 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006)

研究報(bào)告

D－半乳糖致亞急性衰老大鼠尿液排泄情況觀察及其多尿機(jī)制探討

譚瑩1，黃萍2，操紅纓2，陳秋鈴2，吳清和2

(1.云南省藥物研究所藥物安全性評(píng)價(jià)中心，昆明 650111; 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006)

目的觀察D－半乳糖(D－gal)致亞急性衰老大鼠在尿液排泄方面的特點(diǎn)并探討其多尿癥狀機(jī)制。方法在初篩合格的SD大鼠頸背部皮下注射濃度為5%的D－gal生理鹽水溶液125 mg/(kg·d)連續(xù)8周。觀察動(dòng)物在造模期間和停止造模后兩周內(nèi)24 h總尿量及水負(fù)荷后排尿情況的變化;通過(guò)測(cè)定模型動(dòng)物尿中K+、Na+、CL－濃度，血中ALD、ADH、ANP濃度及腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察，探討模型動(dòng)物24 h總尿量增加的機(jī)制。結(jié)果與正常對(duì)照組相比較，模型組動(dòng)物24 h總尿量明顯增加;水負(fù)荷后6 h內(nèi)排尿潛伏期明顯縮短，排尿次數(shù)明顯增多，但總尿量沒(méi)有明顯差異;模型動(dòng)物尿中Na+、CL－濃度明顯升高，K+濃度明顯降低;血漿ALD、ADH含量顯著降低，ANP含量顯著增加，腎臟出現(xiàn)一系列硬化特征。結(jié)論D－gal致亞急性衰老大鼠出現(xiàn)的總尿量增加和排尿次數(shù)增多的情況可能與其ADH、ALD、ANP合成與分泌異常及腎臟病理形態(tài)學(xué)改變有關(guān)。

D－gal致亞急性衰老大鼠;多尿;機(jī)制

D－半乳糖(D－gal)致亞急性衰老動(dòng)物模型是目前研究較為成熟，運(yùn)用較為廣泛的衰老動(dòng)物模型，其在外觀形態(tài)，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、各主要臟器生理功能及病理形態(tài)改變等方面均與自然衰老動(dòng)物具有較高的相似度。該動(dòng)物的制備相對(duì)簡(jiǎn)單易行，模型較為穩(wěn)定可靠，被廣泛用于延緩衰老和防治老年癡呆藥物的篩選和作用機(jī)制探討。本研究對(duì)該種動(dòng)物模型的尿液排泄情況進(jìn)行初步觀察，并通過(guò)測(cè)定與尿液生成密切相關(guān)的部分神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)指標(biāo)，初步探討其多尿機(jī)制，旨在為該模型的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2月齡SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量160～180 g，來(lái)源于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK (粵)2003－0002］。動(dòng)物于室內(nèi)溫度(20±2)℃，濕度(50±5)%的環(huán)境中飼養(yǎng)，每籠5只，采用12 h∶12 h晝夜間斷照明，每天定量添加飼料1次，換水2次，更換墊料2次，動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，SPF級(jí)飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

D－galactose，成都Mechem公司產(chǎn)品，由廣州威佳有限公司分裝，批號(hào)070918;Goat anti－rat arginine vasopressin enzyme immunoassay kit，catalogue No: QR301330103031 EIAUTL;Goat anti－rat atrial natriuretic polypeptide enzyme immunoassay kit，catalogue No:QRCT－3013321020009 EIAUTL; Goat－anti rat aldosterone enzyme immunoassay kit，以上試劑盒均為美國(guó)Ad litteram Diagnostic Laboratories，Ins產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物篩選:根據(jù)改良的Aston［1，2］法結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制定動(dòng)物初篩標(biāo)準(zhǔn)。取大鼠80只，雌雄各半，適應(yīng)代謝籠1 d，于次日禁食不禁水18 h后，灌胃給予生理鹽水作為水負(fù)荷2次，第1次3 m L/100 g，收集30 min尿液，第2次2 m L/100 g加30 min的尿量作為水負(fù)荷，收集2 h的尿量，淘汰排泄率低于25%和高于50%的動(dòng)物(排泄率=尿量/給水量)。

1.3.2 動(dòng)物分組:將初篩合格的動(dòng)物分為正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。模型組大鼠在消毒后的頸背部皮膚，用無(wú)菌注射器注射濃度為5%的D－gal生理鹽水溶液125 mg/(kg·d);正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水，連續(xù)8周，停止注射后繼續(xù)觀察兩周。造模期間每周稱(chēng)重一次，并根據(jù)動(dòng)物體重調(diào)整D－gal的注射量［3－5］。

1.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定方法

1.4.1 排尿情況的觀察［6，7］:①24 h總尿量:從造模開(kāi)始，每周測(cè)定動(dòng)物24 h總尿量一次。具體方法:動(dòng)物禁食不禁水18 h，次日將動(dòng)物置于代謝籠中，禁食，自由飲水，收集24 h尿液(放入和拿出前輕壓大鼠下腹部排盡余尿，每4 h收集尿液1次避免揮發(fā))。②水負(fù)荷后6 h內(nèi)排尿情況:從造模開(kāi)始，每?jī)芍軠y(cè)定動(dòng)物水負(fù)荷后6 h內(nèi)的排尿情況1次。具體方法:據(jù)大鼠體重灌胃給予生理鹽水1 m L/100 g，立即收集30 min尿液，再次給予各組生理鹽水4 m L/100 g加上30 min的尿量(用生理鹽水代替)。將動(dòng)物置于自制的特殊鼠籠中，觀察并記錄動(dòng)物排尿潛伏期，6h內(nèi)排尿次數(shù)及總量。

1.4.2 尿中Na+、K+、CL－濃度:將24 h總尿量測(cè)定實(shí)驗(yàn)中收集的尿液取2 m L分裝于試管中，用全自動(dòng)尿液分析儀測(cè)定Na+、K+、CL－濃度。

1.4.3 血漿ALD、ADH、ANP含量:于實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，大鼠眼眶后靜脈叢取血1.5 m L，分別用肝素及EDTA－Na2、抑肽酶抗凝，室溫下3500 r/min，離心15 m in，吸取上層血漿，用ELISA法測(cè)定血漿中ALD、ADH、ANP濃度，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 24 h總尿量的變化

與正常對(duì)照組相比較，模型組動(dòng)物24 h總尿量自造模后第4周至第10周明顯增加，兩者差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

(注:與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05)圖1 24 h總尿量動(dòng)態(tài)變化Note:Compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01Fig.1 The total volume of urine during 24 h at different times

2.2 水負(fù)荷后6 h排尿的變化

與正常對(duì)照組相比較，造模4周后，模型組動(dòng)物水負(fù)荷后6 h內(nèi)的排尿潛伏期明顯縮短，排尿次數(shù)明顯增加，兩者差異有顯著性(P＜0.05，P＜0.01);但水負(fù)荷后6 h內(nèi)的總尿量，兩組相比較沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2、3。

(注:與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05)圖2水負(fù)荷后6 h內(nèi)排尿潛伏期的變化(Note:Compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01)Fig.2 The incubation period of urination within 6 h after water load

(注:與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05)圖3水負(fù)荷后6 h內(nèi)排尿次數(shù)的變化(Note:Compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01)Fig.3 The frequency of urination within 6 h after water load

2.3 尿液中Na+、K+、CL-濃度的變化

與正常對(duì)照組相比較，模型組大鼠尿液中K+濃度明顯降低，Na+、CL－濃度明顯升高，兩者差異有顯著性(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 尿中Na+、K+、CL－濃度(±s，mmol/L，n= 10)Tab.1 Na+，K+，Cl－level in the normal and model rats

表1 尿中Na+、K+、CL－濃度(±s，mmol/L，n= 10)Tab.1 Na+，K+，Cl－level in the normal and model rats

注:與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05。Note:Compared with the control group，*P＜0.05.

組別(Group)K+Na+CL－正常組(Control)110.32±30.98 30.54±7.56 40.22±9.54模型組(Model)77.54±10.77*70.22±18.02*90.43±16.77*

2.4 血漿ALD、ADH、ANP濃度的變化

從表2可以看出:與正常對(duì)照組相比較，模型組大鼠血漿ANP含量明顯升高，ALD、ADH含量明顯降低，兩者差異均具有非常顯著性意義(P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 血漿ALD、ADH、ANP濃度(±s，pg/m L，n= 10)Tab.2 ALD，ADH，ANP levels in the normal and model rats

表2 血漿ALD、ADH、ANP濃度(±s，pg/m L，n= 10)Tab.2 ALD，ADH，ANP levels in the normal and model rats

注:與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01。Note:Compared with the control group，**P＜0.01.

組別(Group)ALD ADH ANP正常組(Control)112.11±20.11 10.34±2.13 123.11±22.11模型組(Model)76.06±10.3**6.42±1.06**227.35±30.54**

2.5 腎臟組織病理學(xué)觀察

2.5.1 HE染色:與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎單位的數(shù)量明顯減少，部分腎單位代償性肥大，腎間質(zhì)內(nèi)結(jié)締組織增生不明顯;腎小球數(shù)目減少，球內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及腎小球囊壁層上皮細(xì)胞重度增生，系膜容積增大;腎小管萎縮，腎小管和集合管內(nèi)皮細(xì)胞大量增生，部分肥大腎小管細(xì)胞融合，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔縮小，甚至已無(wú)小管管腔結(jié)構(gòu)，部分近曲小管發(fā)生玻璃樣變性。

2.5.2 PAS染色:與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎小球囊壁層內(nèi)皮細(xì)胞明顯增生，系膜增生，毛細(xì)管袢受壓，入球血管萎縮、硬化，基底膜增厚;腎小管萎縮，上皮細(xì)胞脂肪變性，管腔擴(kuò)張，小管內(nèi)皮細(xì)胞增生，基膜增厚。結(jié)果見(jiàn)圖4(彩插3)。

3 討論

D－gal致亞急性衰老動(dòng)物模型是由我國(guó)學(xué)者首先提出的，經(jīng)過(guò)世界范圍內(nèi)的長(zhǎng)期研究和探索，該模型及其衰老學(xué)說(shuō)得到了不斷深入和發(fā)展，但該類(lèi)模型在尿液生成與排泄方面的報(bào)道少見(jiàn)?；诖?，本課題對(duì)該種動(dòng)物模型的尿液排泄情況進(jìn)行了觀察，初步得出了D－gal致亞急性衰老動(dòng)物模型會(huì)出現(xiàn)“多尿”癥狀，包括尿量增多(多尿)和排尿次數(shù)增加(尿頻)。關(guān)于該種動(dòng)物模型總尿量增多的機(jī)制，本課題由以下兩方面進(jìn)行初步探討:

3.1 與尿液生成密切相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)

目前許多學(xué)者認(rèn)為抗利尿激素、心鈉素、醛固酮三者共同作用，是參與維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境最重要的因素，而這些激素的分泌與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)密切相關(guān)。

抗利尿激素(ADH)的主要作用是提高遠(yuǎn)曲小管和集合管對(duì)水的通透性，增加髓袢升支粗段對(duì)NaCL的主動(dòng)重吸收和內(nèi)髓部集合管對(duì)尿素的通透性，使髓質(zhì)組織間液溶質(zhì)增加，滲透濃度提高，利于尿濃縮，是尿液濃縮和稀釋的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)激素［6，7］。醛固酮(ALD)有潴鈉排鉀作用，可促進(jìn)腎臟遠(yuǎn)曲小管及集合管重吸收鈉、水和排鉀，在調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)代謝方面扮演著重要的角色［8］。心鈉素(ANP)具有強(qiáng)大的利鈉、利尿作用，并具有快、短、強(qiáng)的特點(diǎn)，其作用從以下幾個(gè)方面發(fā)揮:①心鈉素可通過(guò)增加腎小球?yàn)V過(guò)率、增加腎髓質(zhì)的血流量及抑制近曲小管和集合管對(duì)鈉的重吸收，產(chǎn)生利尿利鈉作用;②心鈉素能抑制腎近球旁細(xì)胞釋放腎素，并通過(guò)對(duì)腎素－血管緊張系統(tǒng)的抑制以及對(duì)腎上腺皮質(zhì)的直接作用，抑制醛固酮的分泌，它不僅抑制醛固酮的基礎(chǔ)分泌率，亦能抑制由ACTH、血管緊張素、鉀等刺激的醛固酮分泌;③心鈉素亦能抑制抗利尿激素的合成、釋放及作用。據(jù)此，測(cè)定ADH、ALD、ANP對(duì)于分析亞急性衰老動(dòng)物所出現(xiàn)的多尿癥狀具有重要意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，①D－gal致亞急性衰老動(dòng)物血漿ADH含量明顯降低，ADH分泌減少使腎小管對(duì)水液的重吸收功能下降，尿液濃縮過(guò)程障礙，導(dǎo)致尿液排泄增加。②模型動(dòng)物24 h尿液中Na+、CL－排出量增加，K+排出量減少，這與參與腎臟水液代謝調(diào)節(jié)的重要潴鈉激素ALD保Na+排K+的作用恰恰相反，初步考慮該種動(dòng)物模型ALD的合成與釋放受阻，使水的重吸收減少，尿量也隨之增加。經(jīng)測(cè)定亞急性衰老動(dòng)物血漿ALD含量降低，提示該種模型ALD合成與分泌障礙可能是其24 h總尿量增加的原因之一。③衰老動(dòng)物血漿ANP含量明顯增加，說(shuō)明該種動(dòng)物腎小球?yàn)V過(guò)率、腎髓質(zhì)的血流量增加，近曲小管和集合管對(duì)鈉的重吸收減少，使得尿液的排出量增加。同時(shí)，ANP的增加可以抑制了ADH、ALD的分泌和釋放，阻礙尿液的濃縮過(guò)程，從而進(jìn)一步促使模型動(dòng)物尿量增多。另外，ALD、ADH的分泌受到下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸的調(diào)控，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到模型動(dòng)物下丘腦、垂體、腎上腺萎縮，這可能是造成模型動(dòng)物上述激素分泌異常的原因之一，即模型動(dòng)物身體機(jī)體全面衰退，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能老化是其多尿的機(jī)制之一。

3.2 動(dòng)物腎臟形態(tài)、功能的改變

尿的生成包括腎小球的濾過(guò)、腎小管和集合管的重吸收和分泌三個(gè)基本過(guò)程。腎臟是出現(xiàn)衰老比較明顯的臟器之一，衰老腎臟的主要病理改變是腎小球硬化及小管間質(zhì)纖維化，這些改變使得腎臟的生理功能受到很大影響，也是老年出現(xiàn)多種泌尿系統(tǒng)疾病的原因之一［9］。因此，在研究D－gal致亞急性衰老動(dòng)物“多尿”機(jī)制的過(guò)程中，腎臟形態(tài)和功能的研究是一個(gè)重要的方面。有文獻(xiàn)報(bào)道D－gal對(duì)腎臟的損害作用，主要通過(guò)產(chǎn)生大量的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)和氧化應(yīng)激損傷［8］。過(guò)多的AGEs在腎小球系膜和毛細(xì)血管部位沉積，使腎小球體積增大，腎小球系膜膨大，基底膜增厚，腎小球硬化［8］，這與本研究的結(jié)果基本一致。由于腎臟與尿液生成、排泄的關(guān)系較為復(fù)雜，該模型動(dòng)物腎臟形態(tài)學(xué)改變與其“多尿”的關(guān)系還有待進(jìn)一步探討。

(本文圖4見(jiàn)彩插3。)

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Polyuria and Its M echanism in D-Galactose-Induced Aging Rats

TAN Ying1，HUANG Ping2，CAO Hong－yin2，CHEN Qiu－ling2，WU Qing－h(huán)e2
(1.Yunnan Institute of Materia Medica，Kunming 650111，China;
2.Traditional Chinese Medicine University of Guangzhou，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo observe the changes of urination of D－galactose－induced aging rat models and explore its mechanism.M ethods The senescent mouse model was established by subcutaneous injection of D－gal(5%，125 mg/kg·d) for 8 weeks.To measure the total volume of urine during 24 h and the frequency of urination within 6 h after water load during the injection period and convalescent period and detect the contents of ALD，ADH，ANP in blood and K+，Na+，CL－in urine，and examine the renal pathomorphology.Results Compared with the control group，the total volume of urine during 24 h was increased，incubation period shortened and the frequency of urination increased within 6 h after water load(P＜0.05，P＜0.01).The concentration of Na+，CL－，ANP was increased and the ADH，ALD，K+decreased(P＜0.05，P＜0.01).At the same time，some renal histological changes were observed in the aging models.ConlusionThe D－galactoseinduced aging rat models have characteristics of polyuria.The mechanism of their polyuria is related with decreased ADH and ALD synthesis and secretion，increased ANP increase，and sclerotic alterations of the kidneys.

D－gal mimetic aging rats;Urination;Polyuria;Mechanism

R－33

A

1005－4847(2010)04－0296－04

2009－12－21

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):30873425)。

譚瑩(1979－)，女，博士，云南省藥物研究所藥物安全性評(píng)價(jià)中心。

吳清和，男，教授，博士生導(dǎo)師，E－mail:zyylb@gzhtcm.edu.cn