成鋼，羅賽群，蓋楠，熊德慧，李榮，胡維新

(中南大學生物科學與技術(shù)學院分子生物學研究中心，長沙 410078)

研究報告

東方田鼠胚胎成纖維細胞永生化細胞系的建立

成鋼，羅賽群，蓋楠，熊德慧，李榮，胡維新

(中南大學生物科學與技術(shù)學院分子生物學研究中心，長沙 410078)

目的建立東方田鼠胚胎成纖維永生化細胞系，為全面研究東方田鼠抗日本血吸蟲機制以及開展不同動物成纖維細胞間比較研究奠定基礎和提供細胞實驗材料。方法運用脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染法將pSV3 neo質(zhì)粒導入第3代東方田鼠胚胎成纖維細胞，經(jīng)G418篩選抗性克隆并擴大培養(yǎng)，建立永生化細胞系;用PCR檢測細胞株中SV40T基因的整合，RT－PCR鑒定SV40T基因在轉(zhuǎn)染細胞中的表達;繪制東方田鼠胚胎成纖維永生化細胞生長曲線。結(jié)果陽性細胞克隆已擴大培養(yǎng)并穩(wěn)定傳代50代，經(jīng)鑒定SV40 T抗原已整合到東方田鼠胚胎成纖維細胞中且穩(wěn)定表達。結(jié)論成功建立東方田鼠胚胎成纖維永生化細胞系。

東方田鼠;胚胎成纖維細胞;永生化;SV40T抗原

東方田鼠(M icrotus fortis，M f)是一種棲居于我國長江流域的嚙齒類動物，流行病學調(diào)查和人工感染實驗均證明其對日本血吸蟲感染具有天然抗性，且這種抗性能穩(wěn)定遺傳［1］。我們前期實驗已對M f胚胎成纖維細胞(Microtus fortis embryonic fibroblasts，M fEF)成功培養(yǎng)并進行了相關生物學特性觀察。建立永生化M f胚胎成纖維細胞系，是M f實現(xiàn)實驗動物化，標準化，規(guī)范化的重要基礎，也是研究M f發(fā)揮抗日本血吸蟲作用的重要試驗材料。目前，已建立多種人和小鼠胚胎成纖維細胞系，M fEF的永生化細胞系尚為首次報道。近年來，許多研究應用病毒基因的轉(zhuǎn)染使細胞永生化，為細胞的長期培養(yǎng)和功能研究提供了理想的方法和手段［2，3］。本研究采用脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染法，將質(zhì)粒pSV3 neo(含有SV40 T抗原基因和neo抗性基因)轉(zhuǎn)染第3代M fEF，旨在使其永生化，為M fEF長期培養(yǎng)和全面研究東方田鼠抗日本血吸蟲機制以及開展不同動物成纖維細胞間比較研究奠定基礎和提供細胞實驗材料。

1 材料與方法

1.1 主要材料

20周齡，體質(zhì)量70～80 g的懷孕東方田鼠(長江亞種人工封閉繁育第3代)由中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物學部提供。質(zhì)粒pSV3 neo系中南大學湘雅醫(yī)學院病理生理學教研室惠贈;Taq DNA聚合酶、Hind III、EcoR I、marker均購自日本TaKaRa公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購自安比奧生物技術(shù)有限公司，新生小牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司; Lipofectam ineTM2000，購自Invitrogen Life Technologies公司;DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、G418及Trizol購自美國Gibco公司;其余常用試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR引物由上海英俊生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 東方田鼠胚胎成纖維細胞的原代培養(yǎng):取妊娠12～13 d的孕鼠，乙醚麻醉后無菌取出子宮，用PBS漂洗3次，棄除表面血污，剪開子宮，取出帶有胎膜的胚胎，用鑷子撕破胎膜，取出胎鼠，剔除胎盤、胚頭、內(nèi)臟和四肢，無菌PBS漂洗3次，剔除可能附帶的脂肪組織、被膜結(jié)締組織、壞死組織以及紅細胞，將鼠胚軀干剪成約1 mm3的碎塊，放入離心管后用培養(yǎng)液反復吹打，靜置沉淀5 min，吸取上清于培養(yǎng)瓶內(nèi)，在含15%FBS、100 U/m L青霉素、100 U/ m L鏈霉素的DMEM，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)［4］。

1.2.2 質(zhì)粒pSV3 neo的擴增與轉(zhuǎn)染:質(zhì)粒pSV3 neo提取、鑒定均按試劑盒操作說明進行。根據(jù)Invitrogenlife technologies公司提供的轉(zhuǎn)染操作說明書進行基因轉(zhuǎn)染:第3代M fEF細胞融合率達到70%～80%時，用無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)基分別將8～10 μg pSV3 neo質(zhì)粒DNA和15～20 μL脂質(zhì)體試劑稀釋至500 μL;將稀釋的DNA與脂質(zhì)體混合，室溫靜置20 min。M fEF用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌兩遍后，加入上述1 m L質(zhì)粒與脂質(zhì)體的混合物，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱孵育6～12 h，即完成轉(zhuǎn)染過程。

1.2.3 轉(zhuǎn)染陽性克隆細胞的篩選及擴大培養(yǎng):轉(zhuǎn)染完成后更換普通培養(yǎng)基，將細胞接種于六孔板，24～48 h后更換含800 μg/m L G418的培養(yǎng)基開始篩選。陽性細胞克隆生長至一定數(shù)目后擴增培養(yǎng)。細胞的換液、傳代、凍存及復蘇按常規(guī)方法進行，復蘇后臺盼藍染色，計算細胞存活率。

1.2.4 SV40T基因在永生化細胞中的整合及表達:①PCR擴增:收集第5代和第20代細胞樣品，提取培養(yǎng)細胞的基因組DNA。根據(jù)SV40大T抗原基因序列設計引物，上游，5′－TGTGGTATGGCTGATT ATGA－3′;下游，5′－CGCAGTGAGTTTTTGTTAGA－3′，擴增產(chǎn)物為391 bp。反應條件:95℃預變性4 m in，然后95℃30 s，56℃30 s，72℃60 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。②RT－PCR分析:按Trizol試劑盒操作法提取培養(yǎng)細胞的RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄。SV40大T抗原基因引物序列及大小同上。內(nèi)參引物為β－actin，上游引物:5′－GTGGGAATTCGTCAGAAGGACTCCTATG TG－3′，下游引物:5′－GAAGTCTAGAGCAACATAGC ACAGCTTCTC－3′，擴增產(chǎn)物為260 bp，反應條件同上，PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染后M fEF生長情況比較:取未轉(zhuǎn)染的第3代M fEF和轉(zhuǎn)染后第15代M fEF分別接種至48孔板，每孔接種10 000個細胞，每種濃度重復三孔，用血球計數(shù)板每天計數(shù)取平均值，連續(xù)7 d，繪制細胞生長標準曲線。

2 結(jié)果

2.1 永生化M fEF的生物學性狀

倒置顯微鏡觀察:剛傳代接種的單個M fEF呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中，胞質(zhì)透明，1～2 h后開始貼壁，細胞呈纖維狀生長，表面顆粒少，胞質(zhì)飽滿，輪廓清晰且細胞增殖較快，培養(yǎng)24～48 h可長滿瓶底(圖1，彩插3);永生化M fEF與原代M fEF相比，可見較多的細胞分裂相和增殖細胞，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與原代細胞無明顯差異，細胞傳代后貼壁速度較原代細胞稍慢。

2.2 質(zhì)粒pSV3 neo酶切鑒定

質(zhì)粒pSV3 neo經(jīng)EcoR I酶切，可見8.8 kb片段，經(jīng)Hind III酶切，可見4.6、3.1、1.4、0.64 kb幾個片段(圖2)。

2.3 永生化M f胚胎成纖維細胞系的建立

注:M.DNA marker;1.質(zhì)粒pSV3neo經(jīng)Hind III酶切;2.質(zhì)粒pSV3neo經(jīng)EcoR I酶切;3.pSV3neo質(zhì)粒。圖2質(zhì)粒pSV3 neo酶切鑒定結(jié)果Note:M.DNA marker;1.pSV3neo plasmid digested with Hind III;2.pSV3neo plasmid digested with EcoR I;3.pSV3neo p lasmidFig.2 Restriction endonuclease digestion analysis of the p lasmids

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將質(zhì)粒pSV3 neo導入第3代M fEF內(nèi)，經(jīng)G418篩選，第6天即長出M fEF陽性克隆(圖3，彩插3)。陽性克隆經(jīng)擴大培養(yǎng)目前已穩(wěn)定傳代4個月，經(jīng)鑒定SV40 T抗原已整合到M fEF中且穩(wěn)定表達，細胞系命名為M fEF永生化細胞系。細胞按常規(guī)方法凍存，液氮凍存3個月后解凍復蘇細胞接種存活率達80%以上。M fEF永生化細胞系目前已連續(xù)傳代50代。

2.4 SV40 T基因在永生化細胞系中的整合及表達

對第5代和第20代M fEF永生化細胞系基因組DNA進行PCR，質(zhì)粒pSV3 neo作陽性對照，產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果在391 bp處有一特異擴增條帶，與陽性對照條帶位置相同，而未轉(zhuǎn)染的細胞基因組DNA中無擴增條帶(圖4)。

2.5 RT-PCR結(jié)果

陽性細胞在391 bp處的特異擴增條帶與陽性對照條帶位置相同，而未轉(zhuǎn)染細胞未見該條帶，內(nèi)參引物為β－actin，擴增產(chǎn)物為260 bp(圖5)。

2.6 未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染后M fEF生長情況比較

進行了永生化M fEF與非永生化M fEF生長速率間的比較，在15%血清濃度培養(yǎng)基中，前者在培養(yǎng)第2天即進入指數(shù)增長期，培養(yǎng)第2～4天達到生長高峰，隨培養(yǎng)時間延長細胞逐漸衰亡，細胞生長的每一階段特征較明顯(圖6)。

3 討論

注:M.DNA marker;1.pSV3neo質(zhì)粒擴增片段;2.第5代M fEF擴增片段;3.第20代M fEF擴增片段;4.未轉(zhuǎn)染M fEF擴增片段圖4 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Note:M.W ide range DNA ladde rmarker;1. pSV3neo p lasmid;2.The 5 th passage M fEF cells;3. The 20 th passage M fEF cells;4.untransfected cellsFig.4 Agarose gel analysis of the PCR products

注:M.DNA marker;1.陽性M fEF擴增片段;2.陰性M fEF擴增片段;3.pSV3neo質(zhì)粒擴增片段圖5 SV40 T抗原mRNA在M fEF中的表達Note:M.DNA marker;1.MF embryonic fibroblasts of cell clones;2.untransfected cells;3.pSV3neo plasmidFig.5 RT－PCR analysis of SV40 T antigen mRNA in the M fEF cells

前期實驗結(jié)果表明:體外培養(yǎng)的M fEF增殖能力較弱，生長較緩慢，一般只能傳代培養(yǎng)8～9代，極大地限制了M fEF的相關應用研究。細胞永生化是目前組織工程學領域研究的熱點。SV40(sim ian virus 40)是20世紀60年代初發(fā)現(xiàn)并分離出的猿猴腎細胞病毒，具有轉(zhuǎn)化動物細胞和誘發(fā)腫瘤的特性［5］。SV40 T基因目前被廣泛用于轉(zhuǎn)基因動物模型的建立和各種人類及動物細胞的永生化，SV40 T

圖6 未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染后M fEF生長情況比較Fig.6 Comparison of the growth of pSV3neo plasmid－transfected and nontransfected M fEF cells

抗原基因的導入能加快轉(zhuǎn)化細胞的生長速率，同時也能保留其原始細胞的許多分化表型，可作為體外研究原始細胞的標準細胞模型［6，7］。本研究將含有SV40 T基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的M fEF，建立永生化細胞系，永生化M fEF與非永生化M fEF相比，可見較多的細胞分裂相和增殖細胞，細胞傳代后貼壁速度較原代細胞慢;傳代、凍存和復蘇均不改變細胞形態(tài)和增殖能力。在實驗中我們發(fā)現(xiàn):永生化M fEF傳代培養(yǎng)時對細胞密度和胰酶消化時間較敏感，如果細胞傳代密度過稀，胰酶消化時間過短，則M fEF在增殖過程中會出現(xiàn)小囊泡狀物，懸浮于培養(yǎng)液中，如果細胞生長過密也會出現(xiàn)這種情況，通過更換培養(yǎng)液和及時傳代可消除此現(xiàn)象。本研究顯示:利用SV40 T基因使M fEF永生化是一種可行、可重復的建系方法。M fEF永生化細胞系的建立可為M f的相關研究提供細胞、蛋白質(zhì)、DNA、RNA樣本，與活體樣本相比，細胞系可以連續(xù)培養(yǎng)，反復凍存，便于管理和使用，而且不會因為個體遺傳差異和生理狀態(tài)影響實驗的可重復性，為M fEF長期培養(yǎng)和全面研究東方田鼠抗日本血吸蟲機制奠定了基礎。

(本文圖1、3見彩插3)。

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Estab lishm ent of an Imm ortalized M icrotus fortis Em bryonic Fibrob last Cell Line

CHENG Gang，LUO Sai－qun，GAI Nan，XIONG De－h(huán)ui，LI Rong，HU Wei－xin
(Molecular Biology Research Center，School of Biological Science and Technology，Central South University，Changsha 410078，China)

Objective To establish an immortalized Microtus fortis embryonic fibroblast(M fEF)cell line in order to lay the foundation for further studies on M icrotus fortis against Schistosma japonicum infection and for comparative study of fibroblasts from different animals.M ethods A mammalian expression vector(pSV3 neo)containing the SV40 large T antigen was used to transfect the 3rd passage M fEF cells using LipofectamineTM2000.Colonies were screened by G418 and expanded into immortalized cell lines.PCR was used to detect the integration of the large T antigen with genome in the Microtus fortis embryonic fibroblasts.Expression of SV40 large T antigen gene in the expanded cells was identified by RTPCR.ResultsStable growth and serial propagation were observed in the immortalized M icrotus fortis embryonic fibroblast line.The mRNA of SV40 T antigen gene was expressed in cells of the immortalized cell line.ConlusionAn immortalized cell line of M icrotus fortis embryonic fibroblasts has been successfully established.

M icrotus fortis;Embryonic fibroblasts;Immortalization，SV40 T antigen

Q25

A

1005－4847(2010)04－0292－04

2010－01－08

國家自然科學基金項目(30400256);湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(No.2340－74236000001)資助。

成鋼(1976－)，男，講師，博士研究生，研究方向:東方田鼠抗日本血吸蟲抗性相關基因篩選。E－mail:chenggang876@126. com。

胡維新(1950－)，男，教授，博士生導師。E－mail:weixinhu@yahoo.com.cn