范薇，隋麗華，劉大偉，趙爽，張慧洋，趙源，汪舟佳，劉永梅

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心，雅安 625014; 3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所，北京 100071)

研究報(bào)告

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CAR桿菌16SrRNA基因PCR監(jiān)測(cè)方法的建立

范薇1，2，隋麗華1，劉大偉3，趙爽1，張慧洋1，趙源1，汪舟佳3，劉永梅1

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心，雅安 625014; 3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所，北京 100071)

目的建立CAR桿菌的PCR監(jiān)測(cè)方法，篩查國(guó)內(nèi)部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本中CAR桿菌攜帶狀況。方法利用CAR桿菌的特有16SrRNA基因序列片段267bp設(shè)計(jì)引物，通過(guò)從日本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所獲取的CAR標(biāo)準(zhǔn)株DNA，建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CAR桿菌16SrRNA基因PCR監(jiān)測(cè)方法。結(jié)果利用建立的CAR桿菌16SrRNA基因PCR監(jiān)測(cè)方法對(duì)國(guó)內(nèi)455份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本進(jìn)行篩查，未檢出CAR桿菌感染。結(jié)論建立了敏感性好，特異性高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CAR桿菌PCR監(jiān)測(cè)方法，未見(jiàn)動(dòng)物攜帶CAR桿菌。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物;CAR桿菌;16S rRNA;PCR

CAR桿菌(cilia－associated respiratory bacillus)是目前尚未分類(lèi)的、一種實(shí)驗(yàn)嚙齒類(lèi)和兔類(lèi)的呼吸道感染細(xì)菌?！癈AR”由Ganaway1985年首次提出并使用，因該細(xì)菌未被分類(lèi)鑒定并命名，所以一直沿用至今［1］。近年來(lái)各種呼吸道疾病的暴發(fā)，人們開(kāi)始對(duì)各種呼吸道傳染性疾病病原的相關(guān)研究給予足夠的重視，各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被用于呼吸道疾病，特別是傳染性疾病的模型研究之中。CAR桿菌可以導(dǎo)致無(wú)癥狀的慢性呼吸道疾病，嚴(yán)重影響用于呼吸道相關(guān)疾病研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。歐美許多國(guó)家和企業(yè)都將其列為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必需排除的病原菌之一。目前我國(guó)尚未將CAR桿菌列為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必需檢測(cè)的項(xiàng)目，對(duì)該菌的研究處于一個(gè)基本空白的狀態(tài)，缺乏病原學(xué)、流行病學(xué)的相關(guān)資料以及有效的檢測(cè)方法［2］。

為了解我國(guó)CAR桿菌流行情況，建立相關(guān)的快速檢測(cè)方法，本研究擬利用CAR桿菌特有的16SrRNA基因序列片段，建立CAR桿菌的PCR監(jiān)測(cè)方法，并對(duì)國(guó)內(nèi)455份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本進(jìn)行了篩查，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株:陽(yáng)性對(duì)照CAR桿菌小鼠株DNACARM由日本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所伊藤豐志雄教授惠贈(zèng)。E.coli DH5α由本室保存，pGEM－T克隆載體為Promega公司產(chǎn)品。

1.1.2 工具酶、試劑和抗體:各種限制性?xún)?nèi)切酶、PCR試劑為T(mén)aKaRa公司(大連寶生生物工程有限公司)產(chǎn)品;T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒為Promega公司(美國(guó))產(chǎn)品;DNA提取試劑盒、DNA片段純化回收試劑盒為Qiagen公司(德國(guó))產(chǎn)品。

1.1.3 引物設(shè)計(jì):針對(duì)CAR桿菌保守的特有16SrRNA基因序列片段267 bp設(shè)計(jì)了兩條引物: P1:5′－TTA AAG CTC CGG CGC TCG AAG－3′;P2:5′－ACA CCC TTA GAA AAG GGG ATT－3′。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:①北京市內(nèi)多家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)廠家(均持有北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證)提供的清潔級(jí)、SPF級(jí)大鼠200只，體質(zhì)量180～220 g;清潔級(jí)、SPF級(jí)小鼠200只，體質(zhì)量18～22 g，來(lái)源同上。②小型豬25只，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所［SYXK(京)2008－0007］提供，均為3～6月齡，雄性15只，雌性10只。其中五指山小型豬為近交系動(dòng)物，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境5只，飼養(yǎng)于普通環(huán)境5只;廣西巴馬小型豬為封閉群動(dòng)物，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境5只，飼養(yǎng)于普通環(huán)境5只;貴州小型豬為封閉群動(dòng)物，飼養(yǎng)于普通環(huán)境5只。③恒河猴30只，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK－(軍)2007－004】。為患病安樂(lè)死的動(dòng)物，雌性14只，雄性16只，年齡在6月齡～2歲之間。

1.1.5 樣本采集:無(wú)菌打開(kāi)動(dòng)物胸腔，取氣管與肺相連的一段組織，－70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA制備:將肺組織快速解凍，用玻璃勻漿器將組織用PBS進(jìn)行勻漿處理，用Qiagen組織DNA提取試劑盒提取DNA，用于PCR擴(kuò)增。

1.2.2 PCR擴(kuò)增:以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為: 94℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃40 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7m in。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為85 V。

1.2.3 序列測(cè)定:將純化的DNA片段，直接連接pGEM－T克隆載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α，鋪于含IPTG和X－gal的LB平板上，挑取白色菌落進(jìn)行PCR及酶切鑒定。陽(yáng)性克隆使用ABI377全自動(dòng)測(cè)序儀(上海生物工程有限公司)以通用引物(T7，SP6)對(duì)插入片段進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4 DNA提取方法驗(yàn)證:將標(biāo)準(zhǔn)DNA 10 μL加入到已經(jīng)確認(rèn)為陰性的組織勻漿中，同時(shí)與未加陽(yáng)性DNA的樣本勻漿進(jìn)行DNA提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.5 方法特異性驗(yàn)證:將金黃色葡萄球菌，嗜肺巴斯德桿菌，大腸桿菌，綠膿桿菌常規(guī)方法液體培養(yǎng)后，將菌液100℃5min滅活，Qiagen DNA提取試劑盒提取DNA，與標(biāo)準(zhǔn)CAR桿菌DNA同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.6 方法敏感性驗(yàn)證:分別用陽(yáng)性對(duì)照CAR桿菌DNA 2、1、0.5 μL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.7 臨床標(biāo)本普查:將提取的樣品DNA標(biāo)本按照建立的方法條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本擴(kuò)增結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本可見(jiàn)陽(yáng)性267 bp條帶，見(jiàn)圖1。

M:2000 bp DNA marker;1:CAR桿菌。圖1 pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖M:2000 bp DNA marker;1:CAR bacillusFig.1 Electrophoretogram of the PCR amplification products

2.2 序列測(cè)定結(jié)果

經(jīng)序列測(cè)定(圖2，彩插7)，插入片段與GenBank標(biāo)準(zhǔn)株序列同源性為100%(結(jié)果未顯示)。

2.3 DNA提取方法驗(yàn)證結(jié)果

將標(biāo)準(zhǔn)DNA以同樣的方法提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)DNA經(jīng)DNA提取步驟后，仍可擴(kuò)增出267 bp陽(yáng)性條帶，陰性標(biāo)本未見(jiàn)條帶，見(jiàn)圖3。

M:2000 bp DNA marker;1:CAR桿菌;2:陰性標(biāo)本圖3 DNA提取方法驗(yàn)證結(jié)果M:2000 bp DNA marker;1:CAR bacillus;2: Negative sampleFig.3 Validation of the isolation of CAR bacillus DNA

2.4 方法特異性驗(yàn)證結(jié)果

金黃色葡萄球菌、嗜肺巴斯德桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌DNA均未擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，而CAR桿菌DNA可見(jiàn)陽(yáng)性條帶，見(jiàn)圖4。

2.5 方法敏感性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

幾個(gè)不同模板量均可擴(kuò)增到267 bp的陽(yáng)性條帶，見(jiàn)圖5。

2.6 動(dòng)物樣本普查結(jié)果

普查實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本455份，未見(jiàn)陽(yáng)性結(jié)果。

3 討論

對(duì)CAR桿菌感染的診斷比較困難，診斷的方法包括血清學(xué)方法(ELISA、IFA)、PCR以及免疫組化和組織病理學(xué)方法。免疫組化和組織病理學(xué)只能在死亡的動(dòng)物中進(jìn)行。對(duì)組織切片進(jìn)行顯微鏡觀察是CAR桿菌最特異的診斷方法，在肺組織中確證有該菌存在。確診的診斷標(biāo)準(zhǔn)是用W－S染色、銀染以及免疫組化等方法看到定植的組織切片中的纖絲狀細(xì)菌［1，3，4］。血清學(xué)實(shí)驗(yàn)包括ELISA和IFA等是對(duì)CAR桿菌感染群進(jìn)行最初監(jiān)測(cè)一種有效的方法。但是和很多細(xì)菌的血清學(xué)方法一樣，假陽(yáng)性是不可避免的問(wèn)題，因而陽(yáng)性的結(jié)果必須使用其他確認(rèn)病原體方法來(lái)驗(yàn)證［5］。

M:1000 bp DNA marker;1:CAR桿菌;2:金黃色葡萄球菌;3:嗜肺巴斯德桿菌;4:大腸桿菌;5:綠膿桿菌圖4特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果M:1000 bp DNA marker;1:CAR bacillus;2: Staphylococcus aureus;3:Pasteurella pneumotropica;4: Escherichia coli;5:Pseudomonas aeruginosaFig.4 Results of specificity test

M:1000 bp DNA marker;1:2 μL模板;2:1 μL模板; 3:0.5 μL模板圖5敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果M:1000 bp DNA marker;1:2 μL DNA temp late;2:1 μL template;3:0.5 μL DNA temp lateFig.5 Results of sensitivity test

目前常用病原學(xué)的檢測(cè)方法包括兩種:細(xì)菌分離培養(yǎng)和PCR擴(kuò)增［6，7］。CAR桿菌不能在無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，體外培養(yǎng)困難，目前國(guó)際上認(rèn)可的方法包括:1985年Ganaway等報(bào)道的在雞胚尿囊膜上增殖培養(yǎng)該菌，1993年Schoeb建立了小鼠BALB/c3T3細(xì)胞培養(yǎng)的方法，以及使用SPF動(dòng)物直接傳代的方法。這些方法都極易受到樣品中其他細(xì)菌的污染，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。PCR方法是針對(duì)CAR桿菌最迅速的一種診斷方法，可使用鼻拭子和呼吸道組織進(jìn)行檢測(cè)。其相對(duì)簡(jiǎn)單的操作方式可以用于日常的常規(guī)監(jiān)測(cè)［8］。由于目前我國(guó)沒(méi)有該菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，所以用PCR方法來(lái)進(jìn)行篩查，是可操作性較強(qiáng)的監(jiān)測(cè)方式，一旦確定有陽(yáng)性后可以進(jìn)行后續(xù)的研究。

細(xì)菌核糖體16SRNA(16SrRNA)基因高度保守區(qū)為細(xì)菌共有，其基因序列的差異顯示了細(xì)菌種屬的差異。細(xì)菌核糖體16SRNA(16SrRNA)序列分析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定分型上。其優(yōu)點(diǎn)在于，該方法不依賴(lài)于細(xì)菌物的分離培養(yǎng)，是一種非培養(yǎng)分析技術(shù)，能夠快速鑒定那些目前尚不能人工培養(yǎng)或人工培養(yǎng)較為困難的細(xì)菌［9］。因此運(yùn)用16S rRNA基因PCR方法來(lái)進(jìn)行CAR桿菌檢測(cè)，可提供一種相對(duì)簡(jiǎn)單和可操作性強(qiáng)的監(jiān)測(cè)方法。

本研究直接使用陽(yáng)性DNA進(jìn)行擴(kuò)增。為了驗(yàn)證普查所得出的陰性結(jié)果不是樣品DNA在提取過(guò)程中受到破壞所致，將標(biāo)準(zhǔn)DNA以同樣的方法提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示仍然能擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶。證明提取DNA的方法不會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。

對(duì)所建立的方法進(jìn)行了特異性和敏感性驗(yàn)證，結(jié)果顯示特異性較好，其他細(xì)菌未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。敏感性顯示，使用0.5 μL標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA仍可以擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶。

篩查了國(guó)內(nèi)清潔級(jí)，SPF級(jí)大鼠樣本200份，小鼠樣本200份，小型豬樣本25份，恒河猴樣本30份，均未普查到陽(yáng)性結(jié)果，這對(duì)評(píng)價(jià)方法的有效性可能不是一個(gè)有力的佐證，但換言之也可能說(shuō)明我國(guó)未有此種細(xì)菌感染。作為全國(guó)范圍內(nèi)的流行病學(xué)調(diào)查來(lái)看，樣本數(shù)量還相對(duì)較少。另有資料報(bào)道，在兔類(lèi)和其他動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)有此菌的感染［10－12］，因此后續(xù)的工作中可擴(kuò)大宿主的種類(lèi)和進(jìn)行大量的普查，以獲得更加精確的結(jié)果。

(本文圖2見(jiàn)彩插7。)

［1］Ganaway JR，Spenser TH，Moore TD，et al.Isolation， propagation，and characterization of a new ly recognized pathogen，ccilia－associated respiratory bacillus of rats，an etiological agent of chronic respiratory disease［J］.Infect Immune 1985，47(2):472－479.

［2］李紅.我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)質(zhì)量檢測(cè)中亟待解決的若干問(wèn)題［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志，2002，12(6):364－367.

［3］Schoeb TR，Davidson MK，Davis JK.Pathogenicity of ciliaassociated respiratory bacillus isolated for F344，LEW，and SD rats［J］.Vet Pathol.1997，34(4):263－270.

［4］Medina LV，Chladny J，F(xiàn)ortman JD，et al.Rapid way to identify the cilia－associated respiratory bacillus:tracheal mucosal scraping with a modified microwave steiner silver impregnation［J］.Lab Anim Sci.1996，46(1):113－115.

［5］Shoji Y，Itoh T，Kagiyama N.Enzyme－linked immunosorbent assay for detection of serum antibody to CAR bacillus［J］.Exp Animal.1988，37(1):67－72.

［6］Schoeb TR，Dybvig K，Davidson MK，et al.Cultivation of ciliaassociated respiratory Bacillus in artifical medium and determination of the 16s rRNA gene sequence［J］.J Clin Microbiol.1993，31(10):2751－2757.

［7］Cundiff DD，Besch－W illiford CL，Hook RR，et al.Detection of cilia－associated respiratory bacillus by PCR［J］J Clin Microbiol. 1994，32(8):1930－1934.

［8］Kawano A，Nenoi M，Matsushita S，et al.Sequence of 16S rRNA gene of rat－origin cilia－associated respiratory(CAR)bacillus SMR strain［J］.J Vet Med Sci.2000，62(7):797－800.

［9］Woo PC，Lau SK，Teng JH，et al.Then and now:Use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories［J］.Clin Microbiol Infect，2008，14(10):908－934.

［10］Nietfeld JC，F(xiàn)ickbohm BL，Rogers DG，et al.Isolation of ciliaassociated respiratory(CAR)bacillus from pigs and calves and experimental infection of gnotobiotic pigs and rodents［J］.J Vet Diagn Invest.1999，11:252－258.

［11］Bergottini R，Mattielo S，Crippa L，et al.Cilia－associated respiratory(CAR)bacillus infection in adult red deer，chamois，and roe deer［J］.J W ildlife Dis.2005，41(2):459－462.

［12］Easterbrook JD，Kaplan JB，Glass GE，et al.A survey of rodentborne pathogens carried by wild－caught norway rats:a potential threat to laboratory rodent colonies［J］.Lab Anim，2008，42 (1):92－98.

Estab lishm ent of a PCR Assay for Detection of Cilia-Associated Respiratory Bacillus in Laboratory Anim als Based on 16SrRNA Gene Fragm ent Sequence

FAN Wei1，2，SUI Li－h(huán)ua1，LIU Da－wei3，ZHA0 Suang1，ZHANG Hui－yang1，ZHAO Yuan1，WANG Zou－jia3，LIU Yong－mei1
(1.Laboratory Animal Center，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China; 2.Research Center of Avian Diseases，College of Veterinary Medicine of Sichuan Agricultural University，Yaan 625014，China; 3.Institute of Disease Control and Prevention，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071)

Objective To establish a PCR assay for detection of cilia－associated respiratory bacillus，and to identify the infectious status of clinical samples from m ice，rats，mini pigs，rhesus monkeys，etc.M ethods The specific primers were designed according to the 267 bp 16SrRNA gene fragment sequence.Then the PCR assay was established by using DNA copy from Japan.ResultsFour hundred fifty five clinical samples were tested by this established method and no positive CAR bacillus infection was detected.ConlusionThe method established in this study is efficient with high sensitivity and specificity.The infection of CAR bacillus hasn’t been detected in laboratory animals in Beijing up to now.

Cilia－associated respiratory bacillus;16S rRNA;PCR;Laboratory animals

R332

A

1005－4847(2010)04－0308－04

2009－12－14

2004國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)工作重點(diǎn)項(xiàng)目(課題號(hào)2003DIA7J033)。

范薇(1973－)，副研究員。目前從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物研究。E－mail:fanwei@bmi.ac.cn