陳 娟，丁蘭平，李 奧，李園園，劉麗麗

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

小球藻是一類真核單細胞藻類，屬于小球藻目（Chlorellales）小球藻科（Chlorellaceae）. 國內(nèi)外廣泛培養(yǎng)的橢圓小球藻（Chlorella ellipsoidea）和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）現(xiàn)分別被命名為橢圓球藻（Chloroidium ellipsoideum） 和 蛋 白 核 異 養(yǎng) 球 藻（Auxenochlorella pyrenoidosa），與小球藻屬（Chlorella）一起統(tǒng)稱為小球藻類（Chlorella complex）[1]. 小球藻類富含蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)和碳水化合物，也是已知含量最高的葉綠素來源，其葉綠素質(zhì)量分數(shù)超過2%[2-3].由于營養(yǎng)價值高且有利于健康，小球藻類已成為人們重要的營養(yǎng)補充劑，也可以加工成動物飼料和其他高價值產(chǎn)品[3-4]. 小球藻的脂質(zhì)含量高，超過大多數(shù)陸生植物，是生物燃料生產(chǎn)的最佳候選微藻物種，也是最具潛力、最能實現(xiàn)可持續(xù)供給油脂的生物質(zhì)資源之一[5-8].另外，作為理想的研究基因表達及生理生化性質(zhì)的藻種，小球藻類也已廣泛應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域[9]. 利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小球藻類具有比較明顯的優(yōu)勢，其分離純化表達產(chǎn)物和操作方法步驟簡單，產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)技術(shù)成熟，適宜于規(guī)?；a(chǎn)[10-11].

我國抗生素的產(chǎn)量和使用量逐年增加，且存在過度使用的情況.抗生素的濫用，對陸地和水體環(huán)境均構(gòu)成了潛在污染[12-13].博來霉素是一種水溶性抗生素，應(yīng)用廣泛.有研究發(fā)現(xiàn)，博來霉素能抑制微擬球藻的生長[14-15].Gus 基因是目前應(yīng)用較多的一種報告基因，可編碼β-葡萄糖苷酸酶，用于檢測外源基因的轉(zhuǎn)化效率，方法簡單且靈敏度高[16].基于人工導(dǎo)入外源目的基因的小球藻類可能在環(huán)境適應(yīng)、生長和油脂轉(zhuǎn)化等方面發(fā)生變化的設(shè)想，本課題組前期利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將Gus 基因成功轉(zhuǎn)入野生型橢圓球藻[17]，期望篩選到適應(yīng)環(huán)境能力強、生長快且產(chǎn)油率高的轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)品系.在此基礎(chǔ)上，本研究擬通過對比分析不同濃度的博來霉素對轉(zhuǎn)基因橢圓球藻pUGus 和野生型橢圓球藻的細胞密度、藻粉和油脂產(chǎn)量的影響，進一步了解外源基因片段對小球藻類敏感性、生長速率和代謝物生成的影響，為篩選環(huán)境適應(yīng)能力強、產(chǎn)油率高的優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因橢圓球藻新品系以及構(gòu)建生物能源生產(chǎn)模式提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藻種

野生型橢圓球藻Chloroidium ellipsoideum（SD-0701），購于中國科學(xué)院淡水藻種庫；pUGus 型橢圓球藻（SD-0702，將Gus 基因轉(zhuǎn)入野生型橢圓球藻），由天津師范大學(xué)微生物實驗室保存.

1.1.2 試劑

葡萄糖、酵母粉、Ca（NO3）2、KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeCl3·6H2O，分析純級（AR），購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；博來霉素，分析純級（AR），購自天津智藍欣佰生物技術(shù)有限責(zé)任公司.

Knap 培養(yǎng)基（/L）：葡萄糖3 g、酵母粉3 g、Ca（NO3）20.1 g、KH2PO40.025 g、MgSO4·7H2O 0.025 g、KCl 0.012 g、FeCl3·6H2O 0.2 g.共設(shè)置9個處理組，博來霉素質(zhì)量濃度梯度為：0（對照組Ⅰ和對照組Ⅱ）、4、6、8、10、12、14 和16 μg/mL，每組各3個重復(fù)，共27個處理.

1.2 方法

取對照組Ⅰ處于對數(shù)生長期的2 種橢圓球藻細胞各3.676×107個，分別轉(zhuǎn)接至對照組Ⅱ和7個博來霉素含量不同的處理組中，培養(yǎng)基體積為30 mL，保證每瓶接種量一致，光照強度50 μmol/（m2·s）、25 ℃條件下靜置培養(yǎng)8 d，每組各3個重復(fù)，共24個處理.

1.2.1 標準曲線繪制

藻液細胞密度與吸光度標準曲線繪制：取對照組Ⅰ中處于指數(shù)期或者穩(wěn)定期的密度較大且無污染的藻種原液，分別稀釋2、4、6、10、20、40、60 和100 倍，利用分光光度法和血球計數(shù)法測定不同稀釋倍數(shù)藻液的OD680值和細胞密度，以細胞密度為橫坐標，OD680值為縱坐標，得到藻液吸光度與細胞密度的標準曲線：y0=25.879x-1.776，R2=0.9756，其中x為細胞密度（106mL-1），y0為藻液的OD680值.

油脂含量與吸光度標準曲線繪制：分別稱取對照組Ⅰ的干制藻粉0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg，以香草醛比色法浸提待測樣品的總脂[18]，在528 nm 下進行比色.繪制標準曲線：y1=5.8246x+0.0957，R2=0.9970，其中x為油脂質(zhì)量，y1為OD528值.

1.2.2 干藻粉的制備

橢圓球藻培養(yǎng)至第8 天，取各處理組的藻液10 mL，3500 r/min 下離心4 min，去除上清，收獲沉淀.將沉淀在-80 ℃冰箱中反復(fù)凍融2 次，每次間隔12 h，于25 ℃下風(fēng)干約48 h 至恒重.

1.2.3 細胞密度、藻粉產(chǎn)量及油脂含量的測量

每天定時取樣，利用紫外分光光度計測量各個處理組藻液的OD680值，根據(jù)標準曲線y0計算藻液細胞密度.稱量1.2.2 制備的藻粉干重并計算產(chǎn)量.取各處理組干藻粉2 mg，以香草醛比色法制備待測樣品的總脂，測定樣品的OD528值，根據(jù)標準曲線y1計算橢圓球藻的產(chǎn)油率及油脂產(chǎn)量.

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 進行數(shù)據(jù)處理，用Spss17.0 軟件進行單因素方差（One-Way ANOVA）統(tǒng)計分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 博來霉素對橢圓球藻生長的影響

培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的博來霉素，培養(yǎng)期內(nèi)SD-0701 和SD-0702 的生長情況如圖1 所示.

圖1 博來霉素對SD-0701 和SD-0702 細胞密度的影響Fig.1 Effect of zeocin on the cell density of SD-0701 and SD-0702

由圖1 可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，SD-0701和SD-0702 的生長均呈上升趨勢.博來霉素對2個藻株的生長均存在一定的抑制作用，且質(zhì)量濃度越大抑制作用越明顯.比較2個藻株的生長情況可知，博來霉素對野生型橢圓球藻（SD-0701）的抑制作用顯著強于pUGus 型橢圓球藻（SD-0702）.

博來霉素雖然對SD-0701 生長的抑制作用明顯，但受濃度影響較小，在培養(yǎng)的第8 天，對照組中SD-0701 的細胞密度達7.494×108mL-1，各博來霉素濃度處理組中的細胞密度相近，約為0.756×108mL-1.博來霉素對SD-0702 生長的抑制作用明顯受濃度的影響，濃度越高抑制越強烈.不添加博來霉素的2個對照組中，SD-0701 和SD-0702 的生長狀況存在差異，在培養(yǎng)的第8 天，SD-0702 的細胞密度為6.377×108mL-1，低于SD-0701 的細胞密度.SD-0701 在培養(yǎng)基中添加博來霉素后基本處于停止生長的狀態(tài)，博來霉素質(zhì)量濃度為4 μg/mL 時抑制率已經(jīng)達到87.31%；而SD-0702僅在添加14 μg/mL 和16 μg/mL 的博來霉素后基本處于停止生長的狀態(tài)，抑制率分別為88.68%和88.63%，添加4 μg/mL 時抑制率僅為12.23%.由此可見，SD-0701對博來霉素的抗性差，而SD-0702 對博來霉素的抗性較強，且與博來霉素的濃度相關(guān)，低濃度的博來霉素對SD-0702 生長的影響較小，高濃度的抑制作用明顯.

2.2 博來霉素對橢圓球藻藻粉產(chǎn)量的影響

靜置培養(yǎng)的第8 天，各處理組中橢圓球藻藻粉的產(chǎn)量如圖2 所示.

圖2 博來霉素對SD-0701 和SD-0702 藻粉產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of zeocin on the yield of algal powder of SD-0701 and SD-0702

由圖2 可以看出，博來霉素對SD-0701 和SD-0702的藻粉產(chǎn)量均存在一定的抑制作用.培養(yǎng)基中未添加博來霉素時，SD-0701 的藻粉產(chǎn)量略高于SD-0702，分別為3.34 g/L 和3.21 g/L. 添加博來霉素后，因SD-0701 對博來霉素敏感，細胞生長受到嚴重抑制，因此制備不出藻粉.博來霉素對SD-0702 藻粉產(chǎn)量的抑制作用明顯受添加量的影響，濃度越高抑制越明顯.博來霉素質(zhì)量濃度為4 μg/mL 和6 μg/mL 時，SD-0702 的藻粉產(chǎn)量分別降低12.44%和13.81%，隨著博來霉素質(zhì)量濃度的增加，藻粉產(chǎn)量大幅度下降，質(zhì)量濃度為14 μg/mL 和16 μg/mL 時，藻粉產(chǎn)量分別下降58.64%和66.31%.

2.3 博來霉素對橢圓球藻含油率和油脂產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的博來霉素時，各處理組中SD-0701 和SD-0702 的含油率和油脂產(chǎn)量如圖3所示.

圖3 博來霉素對SD-0701 和SD-0702 含油率和油脂產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of zeocin on oil content and yield of SD-0701 and SD-0702

由圖3（a）可以看出，不添加博來霉素時，SD-0701的含油率略高于SD-0702，分別為14.20%和13.61%.培養(yǎng)基中添加博來霉素時，SD-0702 的含油率明顯受博來霉素濃度的影響，低濃度會稍微促進其油脂積累，高濃度則產(chǎn)生抑制作用.博來霉素質(zhì)量濃度為4、6和8 μg/mL 時，SD-0702 的含油率分別為14.38%、14.27%、13.66%，超過對照組的含油率；質(zhì)量濃度為10、12、14和16 μg/mL 時，SD-0702 的含油率分別為13.10%、12.70%、10.26%和9.89%，低于對照組的含油率.

由圖3（b）可以看出，不添加博來霉素時，SD-0701和SD-0702 油脂產(chǎn)量分別為0.474 g/L 和0.436 g/L.博來霉素質(zhì)量濃度較低時（≤6 μg/mL），SD-0702 的油脂產(chǎn)量略有下降，博來霉素質(zhì)量濃度超過6 μg/mL 時，油脂產(chǎn)量急劇下降.

3 討論

本研究以野生型橢圓球藻（SD-0701）和含有外源基因Gus 的橢圓球藻（SD-0702）為實驗材料，在Knap培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的博來霉素，觀察測量2個藻株的生長、藻粉產(chǎn)量、含油率和油脂產(chǎn)量.培養(yǎng)基中不添加博來霉素時，野生型橢圓球藻的細胞密度、藻粉產(chǎn)量、含油率和油脂產(chǎn)量均高于含有外源基因Gus 的橢圓球藻.吳海月等[19]研究發(fā)現(xiàn)，含有外源基因Gus 的藻株性能較野生型藻株低，生長速率低，代時長，藻粉產(chǎn)量低，油脂產(chǎn)量也低，與本研究結(jié)果相符.當(dāng)添加博來霉素時，轉(zhuǎn)入外源基因Gus 的藻株生長速率明顯高于野生型藻株.博來霉素質(zhì)量濃度為4 μg/mL 時，野生型藻株的生長就受到顯著抑制；隨著培養(yǎng)基中博來霉素濃度的增加，轉(zhuǎn)入外源基因Gus 的藻株所受的抑制作用也隨之增強，但在添加14 μg/mL 和16 μg/mL 的博來霉素時才受到較強的抑制作用.張琳等[15]研究表明，微擬球藻對博來霉素高度敏感，在固體培養(yǎng)時，0.5 μg/mL博來霉素即可完全抑制微擬球藻生長，在液體培養(yǎng)時，1 μg/mL 博來霉素即可完全抑制其生長.本研究結(jié)果表明，在Knap 液體培養(yǎng)基中添加4 μg/mL 博來霉素時野生型橢圓球藻基本停止生長，與微擬球藻的完全抑制濃度不同，這可能是由于不同藻種對博來霉素的敏感程度不同.

培養(yǎng)基中添加4 μg/mL 的博來霉素時，2 種橢圓球藻的生長均開始受到抑制，此時博來霉素對SD-0701的抑制率達到87.31%，對SD-0702 的抑制率僅有12.23%.由于SD-0701 在博來霉素質(zhì)量濃度為4 μg/mL時已經(jīng)基本停止生長，藻粉產(chǎn)量微小無法制備，油脂產(chǎn)量極低；但SD-0702 在此質(zhì)量濃度下藻粉產(chǎn)量和油脂產(chǎn)量的抑制率僅分別為12.44%和8.49%，當(dāng)質(zhì)量濃度為16 μg/mL 時藻粉產(chǎn)量和油脂產(chǎn)量的抑制率分別達到66.31%和75.46%. 由此可見，SD-0701 對博來霉素的抗性差，而SD-0702 具有較強抗性，且與博來霉素濃度相關(guān)，高濃度的博來霉素對SD-0702 有顯著抑制作用.

綜合以上結(jié)果，野生型橢圓球藻內(nèi)轉(zhuǎn)入外源基因Gus 確實能夠影響其對抗生素的敏感性、生長速率和代謝物的生成.野生型橢圓球藻對博來霉素很敏感，抗性差；轉(zhuǎn)入外源基因Gus 的橢圓球藻對博來霉素敏感程度弱，抗性較強.相對于野生型橢圓球藻，轉(zhuǎn)入外源基因Gus 的藻株在低抗生素污染的水體中具有適應(yīng)能力強、生長情況好以及產(chǎn)油率高的特性，適合在低污染水體中推廣應(yīng)用.另外，本研究也表明博來霉素可作為篩選培養(yǎng)基，用于識別小球藻類的抗性基因.