石雨鷺，鄭 瑞，靳亞軍，欒維江

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

水稻成花素是抽穗開花的促進(jìn)因子，是一種在葉片中形成并轉(zhuǎn)運到頂端分生組織起作用的小分子蛋白.該蛋白因具有磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP）的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，屬于PEBP蛋白家族.PEBP 基因家族在進(jìn)化上十分保守，廣泛存在于細(xì)菌、動物和植物中[1].就植物中的PEBP 編碼基因而言，根據(jù)編碼氨基酸序列的同源性，又分為FT-like、TFL-like 和MFT-like 3個亞家族[2].FT-like 和TFL-like亞家族基因可能是由MFT-like 亞家族基因進(jìn)化而來[1].

植物成花素基因最早在擬南芥中得到鑒定，擬南芥基因組包含8個PEBP 編碼基因[3]，其中已知的FT是成花素，可以促進(jìn)擬南芥的開花；TFL1 是擬南芥的反成花素，抑制其開花[4].油菜基因組包含26個PEBP 基因[5].大豆基因組包含23個PEBP 基因[6]，其中GmFT2a和GmFT5a 可以調(diào)控開花時間，促進(jìn)大豆的開花[7].水稻基因組包含19個PEBP 基因，其中，13個為FTLike 成員，已明確功能的Hd3a 和RFT1 分別是水稻在短日照（SD）和長日照（LD）條件下的成花素基因[8]，可以在SD 和LD 條件下促進(jìn)水稻的成花，其余成員的功能未知；4個屬于TFL-like 成員，可能具有反成花素作用；2個屬于MFT-like 成員，即OsMFT1 和OsMFT2，它們在種子發(fā)育和萌發(fā)過程中呈現(xiàn)出較高的表達(dá)水平[9]，過量表達(dá)OsMFT1 可推遲開花，并且改變穗型，2個成員的詳細(xì)功能還不明確.

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是近幾年發(fā)展的一種準(zhǔn)確、高效、應(yīng)用廣泛的基因編輯技術(shù)，與鋅指核酸酶技術(shù)（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)（TALENs）相比優(yōu)勢突出[10].CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作用機(jī)理簡單，僅需通過1個sgRNA（single guide RNA） 和核酸酶（Cas9）就可以實現(xiàn)基因的定點編輯[11-12].在gRNA 的引導(dǎo)下識別將要切割的靶序列，由Cas9 蛋白在靶點附近切割DNA 雙鏈產(chǎn)生染色體雙鏈斷裂，隨后通過非同源末端連接進(jìn)行修復(fù)，由于修復(fù)的不準(zhǔn)確導(dǎo)致堿基插入或缺失，從而造成基因突變[13].目前，已有研究表明，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在擬南芥、小麥、水稻、玉米、煙草以及苔蘚植物中得到了應(yīng)用[14].

本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對水稻的OsDTH13基因進(jìn)行定點編輯，并對獲得的編輯植株進(jìn)行測序分析，明確其編輯突變類型，得到了編輯突變體，為后續(xù)OsDTH13 基因的功能研究提供實驗基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

粳稻品種中花11（Oryza sativa L.ssp. Japonica cv.Zhonghua11）及其轉(zhuǎn)基因植株均種植于天津師范大學(xué)實驗田，田間保持常規(guī)管理.

1.2 靶位點選擇及引物設(shè)計

利用E-CRISPR（http：//www.e-crisp.org）在線設(shè)計平臺對OsDTH13 基因的編碼區(qū)序列進(jìn)行分析，選用2個GN19NGG 特征的序列作為編輯靶位點（分別為TG1 和TG2），以提高編輯效率.這2個靶點在目的基因的第一個外顯子上，GC 含量分別為60%和50%，發(fā)夾結(jié)構(gòu)較少. 將設(shè)計好的靶點在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對，證實其具有良好的特異性，脫靶概率低.

1.3 CRISPR/Cas9 載體的構(gòu)建

分別取2個靶點TG1 和TG2 的上下游引物各10 μL，進(jìn)行退火反應(yīng).PCR 反應(yīng)程序為：95℃，3 min；以0.1 ℃/s 的速率降溫至22 ℃，獲得靶點特異片段.含有sgRNA 的OsU6SK 載體用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ進(jìn)行過夜酶切，回收酶切產(chǎn)物，將其分別與2個靶位點特異片段于16 ℃過夜連接.連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR 鑒定.鑒定正確的陽性質(zhì)粒與含有Cas9 的35S-Cas9-SK 載體及雙元pCAMBIA1300載體，分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，回收后進(jìn)行連接，獲得可以轉(zhuǎn)化水稻的雙元重組載體.

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定

將構(gòu)建成功的CRISPR/Cas9 重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因植株.將轉(zhuǎn)基因植株移栽至實驗田，待其生長到5 葉期，收集葉片，用CTAB 法提取水稻基因組DNA.以載體中的特異性潮霉素基因作為選擇標(biāo)記進(jìn)行PCR 分子鑒定.所用PCR 程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min，4 ℃保存.

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的突變類型分析

由于2個靶點TG1 和TG2 的位置相近，因此可以用同一對引物進(jìn)行檢測. 依據(jù)OsDTH13 的基因組序列，在靶點序列上下游約250 bp 處設(shè)計靶點編輯檢測引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測.將PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程股份有限公司測序，測序結(jié)果與野生型序列比對分析.如測序結(jié)果為套峰，則利用在線平臺DSDecodeM（http：//dsdecode.scgene.com/）對突變位點進(jìn)行解碼，并用凝膠電泳進(jìn)行驗證，確定突變類型.

2 結(jié)果與分析

2.1 OsDTH13 序列分析及靶位點的選擇

OsDTH13 基因的DNA 序列長1576 bp，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，編碼序列總長558 bp，編碼186個氨基酸，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示.

圖1 OsDTH13 基因結(jié)構(gòu)及靶點位置Fig.1 Structure of OsDTH13 gene and the position of target sites

依據(jù)OsDTH13 的基因結(jié)構(gòu)特點及靶點設(shè)計原則，在第一個外顯子內(nèi)篩選出了2個打靶效率高、特異性好的靶位點TG1 和TG2，分別位于ATG 后27～46 bp及48～67 bp.由于FT-like 家族成員的同源性較高，本研究通過BLAST 搜尋比對，發(fā)現(xiàn)這2個靶點的脫靶率低，不會造成該家族與其序列相似成員的編輯.

2.2 CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建

分別將2個靶點的正反向引物進(jìn)行退火反應(yīng)，獲得了寡聚二聚體，連接至含有sgRNA 的OsU6SK 質(zhì)粒骨架上，獲得帶有靶點序列的sgRNA 融合載體（OsU6-SK-TG1 和OsU6-SK-TG2）. 重組載體熱激轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR 擴(kuò)增，得到片段大小約為400 bp的目的條帶，如圖2（a）所示，與預(yù)期條帶大小相符.進(jìn)一步提取陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明2個目的靶點分別與OsU6SK 載體連接成功.然后將融合載體OsU6-SK-TG1、OsU6-SK-TG2、含有Cas9 的35S-Cas9-SK 空載體及pCAMBIA1300 雙元載體分別酶切，分別回收帶有靶點的sgRNA 片段、Cas9 片段及pCAMBIA1300 載體骨架進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后獲得重組載體.將重組載體進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示切出了預(yù)期大小的目的片段，如圖2（b）所示，表明帶有靶點的sgRNA 和Cas9 成功連入了pCAMBIA1300 雙元載體中，可以用于后續(xù)的轉(zhuǎn)基因.

圖2 OsDTH13 基因的CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建Fig.2 Construction of CRISPR/Cas9 vector for OsDTH13

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得和分子檢測

重組載體構(gòu)建成功后，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，經(jīng)愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代、農(nóng)桿菌的侵染、抗性愈傷的篩選、分化、生根過程，最終獲得了20 株水稻轉(zhuǎn)基因植株.待轉(zhuǎn)基因植株生長健壯后，單株提取基因組DNA，用載體中特異的潮霉素基因進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果如圖3 所示，有13 株為轉(zhuǎn)基因陽性植株.

圖3 獲得的CRISPR/Cas9 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測Fig.3 Molecular detection of the obtained CRISPR/Cas9 transgenic plants

2.4 突變體的編輯類型分析

為了明確水稻轉(zhuǎn)基因植株中的目的基因是否被編輯，對獲得的全部T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了突變位點分析，采用CTAB 法提取基因組DNA，然后用包含靶點的特異性檢測引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序分析，結(jié)果表明，13 株轉(zhuǎn)基因植株中有5 株發(fā)生了基因編輯（#1～#5）.#1 編輯突變體是一個缺失的純合突變體，在第一靶點PAM 序列-8 處缺失24個堿基，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物比野生型擴(kuò)增產(chǎn)物小，如圖4（a）所示.#2 是一個雜合缺失突變體，其中一條同源染色體在第一靶點PAM序列-4 處缺失了1個堿基，另一條同源染色體在第一靶點PAM 序列-4 處缺失了9個堿基，因此測序結(jié)果出現(xiàn)套峰，如圖4（b）所示.#3 編輯突變體是一個純合突變體，產(chǎn)生了堿基缺失和替換2 種突變形式，PCR檢測結(jié)果表明，突變體擴(kuò)增出的條帶小于野生型，測序后發(fā)現(xiàn)與野生型相比，該突變體的2 條同源染色體在第一靶點PAM 序列-20 處發(fā)生堿基缺失，共缺失32 bp，在第二靶點PAM 序列-13 處由堿基C 替換為堿基G，如圖4（c）所示.#4 編輯突變體是一個含有插入和缺失的雙等位突變體，其中一條同源染色體在第一靶點PAM 序列-4 處缺失了1個堿基，另一條同源染色體序列在第一靶點PAM 序列-4 處插入了1個堿基，如圖4（d）所示. #5 編輯突變體是一個單堿基插入的純合突變體，在第二靶點PAM 序列-6 處插入了1個堿基，如圖4（e）所示.

圖4 編輯突變體的測序分析及PCR 鑒定Fig.4 Sequencing analysis and PCR identification of editing mutants

2.5 突變植株的氨基酸序列分析

OsDTH13 基因的編碼序列長558 bp，編碼的蛋白質(zhì)含有186個氨基酸.利用DNAMAN 軟件對3個純合編輯突變體植株的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與野生型植株相比，突變體所產(chǎn)生的突變導(dǎo)致了部分氨基酸缺失或蛋白質(zhì)翻譯提前終止，如圖5 所示.

在氨基酸水平上，#1 突變體由于缺失24個堿基導(dǎo)致翻譯后缺失了8個氨基酸（圖5 中的#1-allele），并未造成移碼.#3 突變體在第一靶點PAM 序列-20 處缺失32 bp，在第二靶點PAM 序列-13 處由堿基C 替換為堿基G，導(dǎo)致移碼突變，從第10個氨基酸開始與野生型不同，并且終止于第19個氨基酸（圖5 中的#3-allele），最終產(chǎn)生一個僅有19個氨基酸的截短的多肽.#5 突變體是一個單堿基插入的純合突變體，插入造成移碼突變，并提前終止于第30個氨基酸處（圖5 中的#5-allele），產(chǎn)生一個30個氨基酸的截短的多肽.后續(xù)本課題組將利用這些突變體對OsDTH13 基因功能進(jìn)行研究.

圖5 野生型與3個突變體的氨基酸序列比對Fig.5 Comparison of amino acid sequences between wild type and three mutants

2.6 突變體植株的遺傳模式分析

將上述T0代純合編輯突變體獲得的種子進(jìn)行種植，得到T1代突變體植株.以#3 純合突變體為例，對所得的T1代突變體植株提取DNA，用設(shè)計的檢測引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測.結(jié)果顯示，所有T1代植株均表現(xiàn)為純合缺失突變，如圖6 所示.經(jīng)進(jìn)一步的測序驗證，測序結(jié)果與膠圖相符，說明編輯突變體可以穩(wěn)定遺傳.

3 討論與結(jié)論

植物中PEBP 基因家族成員的主要功能是控制植物開花時間和生長發(fā)育.現(xiàn)已明確了擬南芥和水稻中幾個PEBP 基因?qū)﹂_花時間的調(diào)控作用.擬南芥中的FT 和TFL1 可以與14-3-3 蛋白及一個帶有堿性亮氨酸拉鏈蛋白結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子FD1 相互作用形成FAC 復(fù)合體（florigen activation complex），并隨之結(jié)合在AP1 等一些開花基因啟動子區(qū)域，從而誘導(dǎo)植物開花[4，15].水稻中的成花素基因為Hd3a 和RFT1，是擬南芥開花激活子FT 基因在水稻中的同源基因.水稻中2個成花素的作用機(jī)理與擬南芥中的成花素作用機(jī)理保守，成花素首先在細(xì)胞質(zhì)中與受體14-3-3 互作，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與FD1 互作形成FAC 復(fù)合體，促進(jìn)下游OsMADS15 基因的表達(dá)，從而促進(jìn)水稻的開花[15].Qin 等[16]在短柄草中鑒定出一個短日照特異表達(dá)的基因FTL9，F(xiàn)TL9 在短日照條件下促進(jìn)開花，而在長日照條件下抑制開花.目前，在大豆中發(fā)現(xiàn)了10個FT 的同源基因，其中GmFT2a 和GmFT5a 已被證實為主要的開花促進(jìn)因子，2個基因在不同光照條件下對開花的促進(jìn)作用存在差異，在短日照條件下GmFT2a 的開花促進(jìn)效應(yīng)比GmFT5a 更強(qiáng)，而GmFT5a 在長日照條件下的開花促進(jìn)效應(yīng)更強(qiáng)[17].在進(jìn)化過程中，F(xiàn)T 基因的功能逐漸出現(xiàn)分化，一些基因不僅僅調(diào)控植物開花.最近研究表明，水稻的成花素Hd3a 還可以負(fù)向調(diào)控水稻的抗病性，hd3a 突變體提高了水稻對白葉枯病菌的抗性[18].基于此，研究水稻中PEBP 家族不同成員的詳細(xì)功能至關(guān)重要，對于全面理解該家族成員的功能具有重要意義.為揭示水稻中PEBP 家族成員的功能，本研究利用CRISPR-Cas9 技術(shù)創(chuàng)建了OsDTH13 基因的編輯突變體，最終得到了5 株突變體植株，其中2 株為單堿基插入，3 株為小片段的缺失.這些編輯突變體的獲得為OsDTH13 的生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ). 后續(xù)本課題組將利用獲得的能夠穩(wěn)定遺傳的純合突變體材料進(jìn)行表型觀察及基因功能研究，詳細(xì)揭示該基因在水稻中的生物學(xué)功能.