蘇春玉，周之春，朱長(zhǎng)軍

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387；3.天津師范大學(xué)分子細(xì)胞系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

驅(qū)動(dòng)蛋白分子（kinesins）是以細(xì)胞內(nèi)微管為軌道的動(dòng)力蛋白，與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的移動(dòng)、細(xì)胞有絲分裂及減數(shù)分裂、組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育以及神經(jīng)元的發(fā)育及信號(hào)傳導(dǎo)等密切相關(guān)[1].Kif18A 是Kinesin-8 家族中的一員.研究表明，Kif18A 對(duì)有絲分裂過程中的紡錘體微管動(dòng)力學(xué)和染色體振幅起著重要調(diào)控作用[2-3].與其他驅(qū)動(dòng)蛋白分子相同，Kif18A 蛋白由3個(gè)功能域組成：N 端的馬達(dá)結(jié)構(gòu)域（motor domain）、中央卷曲螺旋桿狀結(jié)構(gòu)域（stalk domain）和C 端貨物分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域（tail domain）.Kif18A 利用水解ATP 釋放的能量可以沿著微管向正極末端移動(dòng)，由于其C 末端存在另一個(gè)微管結(jié)合位點(diǎn)，因此Kif18A 能夠穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)到微管正極末端并聚集，進(jìn)而抑制微管的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性[4-7]，通過降低染色體的振蕩速率限制其振蕩幅度[8-10].有絲分裂關(guān)鍵蛋白激酶CDK1 可對(duì)Kif18A 的S674 和S684 氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化修飾，使得Kif18A 無(wú)法到達(dá)動(dòng)粒微管的末端并聚集，因此Kif18A 無(wú)法發(fā)揮其降低微管動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性的功能，使得動(dòng)粒振幅增大[11].據(jù)推測(cè)這可能是因?yàn)镃DK1 的磷酸化修飾影響了Kif18A 的ATP 酶活性，使Kif18A 無(wú)法到達(dá)微管正極末端.

本研究構(gòu)建了Kif18A 突變體的桿狀病毒Kif18AAA（S674A/S684A）和Kif18A-EE（S674E/S684E），利用SF9 細(xì)胞表達(dá)這2 種桿狀病毒蛋白，通過純化獲得Kif18A-AA 和Kif18A-EE 蛋白，檢測(cè)其ATP 酶活性，進(jìn)而分析CDK1 磷酸化修飾對(duì)Kif18A 蛋白ATP 酶活性的影響，為深入理解Kif18A 在細(xì)胞有絲分裂期的功能提供體外實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

昆蟲細(xì)胞SF9，本實(shí)驗(yàn)室自存；pFastBac-HTa、pEGFP-Flag-Kif18A-EE、pEGFP-Flag-Kif18A-AA 質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建；TransT1、DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞、Kif18A 抗體、Kif18A 磷酸化抗體均為實(shí)驗(yàn)室自制.

1.2 試劑

ATPase/GTPase ELIPA Biochem Kit（Catalog number：BK051/52）、Tubulin 和488 Labeled Tubulin，美國(guó)Cytoskeleton 公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；EcoRⅠ和SalⅠ工具酶、SuperFectin 試劑，美國(guó)Thermo Scientific 公司；T4 連接酶，日本Takara 公司；SIM SF 培養(yǎng)基，北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；鼠抗Flag 抗體、Flag Beads 和3×Flag Peptide，美國(guó)Sigma 公司.

1.3 方法

1.3.1 DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化

從-80 ℃冰箱中取出DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，冰上融化后，加入10 ng pFastBac-Flag-Kif18A-EE 或pFast-Bac-Flag-Kif18A-AA 質(zhì)粒，冰上孵育30 min 后，42 ℃水浴鍋中熱激45 s，迅速置于冰上2 min，加入900 μL SOC液體培養(yǎng)基.37 ℃條件下225 r/min 搖菌6 h，之后取100 μL 涂平板（50 μg/mL Kan+，7 μg/mL Gen+，10 μg/mL Tet+，0.1 mol/L IPTG，2%X-gal），將平板倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h.挑取3個(gè)白色克隆轉(zhuǎn)接到LB 液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL Kan+、7 μg/mL Gen+和10 μg/mL Tet+）中，37 ℃過夜培養(yǎng)，提取桿狀病毒基因組.

1.3.2 桿狀病毒基因組提取

將菌液轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中，14000 r/min 離心1 min，真空吸干上清，加入0.3 mL 的Buffer P1（含有RNase A）重懸沉淀，混勻后加入0.3 mL 的Buffer P2，室溫孵育5min.加入0.3mL 醋酸鉀（濃度為3 mol/L，pH 值為5.5），輕輕混勻，蛋白形成白色沉淀. 冰上放置10 min后14000 r/min 離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到含有0.8 mL 異丙醇的離心管中.混勻，冰上放置10 min.室溫下14000 r/min 離心15 min，棄去上清后加入0.5 mL 70%的乙醇，室溫下14000 r/min 離心5 min.室溫放置10 min 風(fēng)干沉淀，加入40 μL pH 值為8.0 的1×TE Buffer 重新溶解DNA 沉淀.-20 ℃儲(chǔ)存.

1.3.3 PCR 驗(yàn)證桿狀病毒基因組

1.3.2 中得到的桿狀病毒基因組須進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，確定其是否為發(fā)生轉(zhuǎn)座的重組基因組. 引物序列：M13F（5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′），Kif18A-R（5′-CTAATGCCATCTCCCTTGAAAG-3′）.PCR體系：93 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min，4 ℃保存. 取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，110 V 恒壓45 min.

1.3.4 重組桿狀病毒基因組感染SF9 細(xì)胞

在60 cm 平板中接種3×106個(gè)SF9 細(xì)胞，27 ℃下培養(yǎng)30 min，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng).吸棄培養(yǎng)基，加入3 mL新鮮培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染試劑（1 μg 病毒基因組DNA，15 μL SuperFectin 轉(zhuǎn)染試劑），邊滴加邊搖勻，27 ℃條件下培養(yǎng)72 h.

1.3.5 桿狀病毒的收取、擴(kuò)增及滴度的測(cè)定

轉(zhuǎn)染72 h 后，收集上清為第一代桿狀病毒，避光保存在4 ℃冰箱中.由于轉(zhuǎn)染所得到的病毒滴度較低，不能高效表達(dá)目的蛋白，因此要進(jìn)行桿狀病毒擴(kuò)增，以增加病毒的滴度.用第一代桿狀病毒分別在10 cm平皿和50 mL 培養(yǎng)瓶中繼續(xù)感染SF9 細(xì)胞，擴(kuò)增桿狀病毒，使其滴度逐步提高. 但過高的感染濃度可能會(huì)產(chǎn)生不完整的目的蛋白，因此通過調(diào)整感染比例（1 ∶100、1 ∶500、1 ∶1000、1 ∶5000）和感染時(shí)間（36、48、60、72 h）得到病毒表達(dá)蛋白的最佳條件.

1.3.6 Kif18A 突變體蛋白的表達(dá)和純化

在50 mL 錐形瓶中接種SF9 細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×106mL-1，以桿狀病毒最佳感染濃度感染SF9 細(xì)胞，27 ℃條件下懸浮培養(yǎng)，在病毒表達(dá)蛋白的最佳時(shí)間收取細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀凍存于-80 ℃冰箱中.

由于Kif18A 突變體蛋白在SF9 細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，因此蛋白要進(jìn)行純化. 通過對(duì)融合到目的蛋白中的Flag 標(biāo)簽蛋白進(jìn)行純化，就可以得到目的蛋白.向50 mL SF9 細(xì)胞沉淀中加入2 mL 裂解液（0.3 mol/L NaCl，20 mmol/L pH 值為7.5 的Tris-Cl，1%NP-40，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT，10 mmol/L β-ME，0.5 mmol/L ATPNa，1μg/mL Approtinin，1×Cocktail，50 μmol/L Na3VO4），將細(xì)胞沉淀重懸后，冰上裂解60 min，將液體轉(zhuǎn)移至2 mL 離心管中.4 ℃下14000 r/min 離心30 min，轉(zhuǎn)移上清到2 mL 離心管中. 加入25 μL Flag Beads，4 ℃下旋轉(zhuǎn)孵育2 h 后收集上清，用洗液（0.3 mol/L NaCl，20 mmol/L pH 值為7.5 的Tris-Cl，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT，10 mmol/L β-ME，0.5 mmol/L ATP-Na，1μg/mL Approtinin，1×Cocktail，50 μmol/L Na3VO4）清洗Beads 3 次，加入洗脫液（3×Flag Peptide，稀釋比例為1 ∶20）4 ℃下洗脫2 h，收集第1 次洗脫樣品.再次加入洗脫液，4 ℃下過夜，洗脫后收集第2 次洗脫樣品.將2 次所得的純化蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色1 h 后進(jìn)行脫色，觀察蛋白純化的效果.

1.3.7 體外微管合成

根據(jù)微管合成試劑盒（Cat.#TL488M）說明書合成微管. 取1 份分裝好的微管蛋白（Tubulin 和488 Labeled Tubulin 體積比為5 ∶1），迅速加入等量General Tubulin Buffer（80 mmol/L PIPES，2 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L EGTA，1 mmol/L GTP，1 mmol/L DTT，20 μmol/L Taxol）.37 ℃水浴合成2 h 后，取0.5 μL 滴片，鏡下觀察微管合成情況，室溫保存合成的微管.

1.3.8 Kif18A 突變體蛋白的ATP 酶活性測(cè)定

首先根據(jù)ATPase/GTPase ELIPA Biochem Kit 說明書繪制磷酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線. 將1mL ELIPA 反應(yīng)溶液、12.5 μL ELIPA 試劑2、240 μL ELIPA 試劑1、80 μL合成微管和10 μL Taxol（2 mmol/L）混和后，按每孔147.5 μL 混合液的量在96 孔板中分裝，向每孔中加入1 μg 純化的Kif18A-EE 或Kif18A-AA 蛋白，每種蛋白設(shè)置3個(gè)重復(fù). 以不加目的蛋白為空白對(duì)照，用洗脫液補(bǔ)齊.設(shè)置好分光光度計(jì)參數(shù)，在加入ATP 前預(yù)先測(cè)定2 組吸光度值.用排槍移液器同時(shí)向混合液中加入10 μL ATP 溶液，立刻置于分光光度計(jì)中測(cè)定不同孔的360 nm 處的吸光度值（OD360），每1 min 測(cè)1 次，連續(xù)測(cè)量1 h.處理數(shù)據(jù)，繪制ATP 酶活性曲線.

1.4 數(shù)據(jù)處理

將測(cè)得的3 組OD360取平均值，用目的蛋白的OD360減去空白對(duì)照的OD360，根據(jù)磷酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出差值對(duì)應(yīng)的磷酸根的物質(zhì)的量.用加入ATP 后的磷酸根物質(zhì)的量減去加入ATP 前的數(shù)值，得到目的蛋白水解ATP 產(chǎn)生的磷酸根物質(zhì)的量，分別根據(jù)2 種蛋白對(duì)應(yīng)的磷酸根物質(zhì)的量繪制ATP 酶活性曲線.

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒pFastBac-Kif18A-EE 和pFastBac-Kif18AAA 的構(gòu)建與鑒定

用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切pEGFP-Flag-Kif18AEE、pEGFP-Flag-Kif18A-AA、pFastBac-HTa 質(zhì)粒后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1 所示.pEGFP 空質(zhì)粒大約為4800 bp，Kif18A cDNA 長(zhǎng)度為2697 bp，因此電泳前面的條帶為Flag-Kif18A-EE 和Flag-Kif18A-AA.pFastBac-HTa 質(zhì)粒長(zhǎng)度為4855 bp，與DNA marker 進(jìn)行比對(duì)，位置正確.

圖1 酶切3 種質(zhì)粒后的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.1 Electrophoresis of agarose gel of three kinds of plasmid after digestion

通過瓊脂糖凝膠回收試劑盒得到Flag-Kif18AEE、Flag-Kif18A-AA 和pFastBac-HTa 的線性DNA，電泳結(jié)果如圖2 所示.

圖2 膠回收后3 種質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Electrophoresis of agarose gel of three kinds of plasmid after gel extraction

通過T4 連接酶16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化TransT1 感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆，液體培養(yǎng). 通過小提質(zhì)粒試劑盒提取pFastBac-Kif18AEE、pFastBac-Kif18A-AA 質(zhì)粒. 質(zhì)粒經(jīng)過測(cè)序后與NCBI 公布的序列進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證.

2.2 桿狀病毒基因組的制備及驗(yàn)證

將pFastBac-Kif18A-EE、pFastBac-Kif18A-AA 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至DH10 Bac 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取白色克隆過夜培養(yǎng)，提取桿狀病毒基因組.當(dāng)目的基因插入到桿狀病毒基因組中，如圖3 所示，會(huì)得到含有目的基因的重組桿狀病毒基因組. 使用轉(zhuǎn)座位點(diǎn)上游存在的M13 上游引物和目的片段中設(shè)計(jì)的下游引物進(jìn)行PCR，可得到大小為3707 bp 的DNA 片段.對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，條帶大小與理論值相符，證明確實(shí)發(fā)生了轉(zhuǎn)座，獲得了重組桿狀病毒的基因組.

圖3 重組桿狀病毒基因組的驗(yàn)證Fig.3 Verification of recombinant baculovirus genome

2.3 桿狀病毒的擴(kuò)增及蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

將重組的桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)染SF9 細(xì)胞后，桿狀病毒在SF9 細(xì)胞中進(jìn)行組裝和增殖.當(dāng)SF9 細(xì)胞中的病毒過多時(shí)，桿狀病毒就會(huì)從SF9 細(xì)胞中釋放，進(jìn)一步感染其他的SF9 細(xì)胞.但病毒擴(kuò)增到一定程度后，可能會(huì)表達(dá)不完整的Kif18A 蛋白，因此需要優(yōu)化Kif18A突變體蛋白表達(dá)的病毒感染條件.以Kif18A-EE 桿狀病毒為例進(jìn)行優(yōu)化過程的描述.通過設(shè)置連續(xù)梯度的感染比例（1 ∶100，1 ∶500，1 ∶1000，1 ∶5000）感染SF9細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)，在表達(dá)時(shí)間（72 h）一致的情況下，可以得到桿狀病毒的最佳感染比例為1 ∶5000，如圖4（a）所示，在此感染比例下未出現(xiàn)雜蛋白. 如果無(wú)論何種感染比例都出現(xiàn)很多雜蛋白，則用1 ∶5000 的感染比例感染SF9 細(xì)胞，分別在36、48、60、72 h 收取細(xì)胞，通過Weatern Blot 驗(yàn)證，得到蛋白的最佳表達(dá)時(shí)間為72 h，如圖4（b）所示.最終得到Kif18A-AA 的最佳感染比例為1 ∶20000，Kif18A-EE 的最佳感染比例為1 ∶5000，最佳表達(dá)時(shí)間均為72 h.

2.4 蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化

按照2 種桿狀病毒表達(dá)目的蛋白的最優(yōu)條件感染SF9 細(xì)胞，收取細(xì)胞后通過蛋白印跡雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所感染的SF9 細(xì)胞大量表達(dá)了目的蛋白，結(jié)果如圖5所示.

圖4 Kif18A-EE 桿狀病毒條件優(yōu)化Fig.4 Condition optimization of Kif18A-EE baculovirus

圖5 桿狀病毒表達(dá)蛋白的鑒定Fig.5 Identification of baculovirus-expressed proteins

由圖5 可以看出，SF9 細(xì)胞表達(dá)的蛋白可以被特異性鼠抗Flag 和兔抗Kif18A 抗體識(shí)別，Kif18A-EE 蛋白可以被特異性抗Kif18A-S674 和S684 位點(diǎn)磷酸化的抗體所識(shí)別，Kif18A-AA 蛋白不能被這些磷酸化抗體識(shí)別.表明Kif18A-EE 蛋白可以很好地模擬磷酸化的Kif18A 蛋白，而Kif18A-AA 蛋白模擬了非磷酸化的Kif18A 蛋白.

隨后利用Flag Beads 純化上述蛋白，純化后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后脫色，觀察目的蛋白的純化效果，結(jié)果如圖6 所示.純化得到的Kif18A-EE 和Kif18A-AA 蛋白濃度分別為0.12 μg/μL和0.10 μg/μL.

圖6 Kif18A-AA 和Kif18A-EE 的蛋白純化Fig.6 Purification of Kif18A-AA and Kif18A-EE

2.5 微管體外合成

Kif18A 作為一種驅(qū)動(dòng)蛋白，能夠利用水解ATP 釋放的能量沿著微管向正極末端移動(dòng). Kif18A 要發(fā)揮ATP 酶活性，需要微管參與，因此必須進(jìn)行體外微管合成.微管蛋白在GTP 存在下傾向于聚合，但聚合的微管并不穩(wěn)定，所以在合成微管的過程中加入Taxol.微管蛋白通過聚合，合成了相對(duì)獨(dú)立的微管，如圖7所示，在熒光顯微鏡下觀察，可以看到發(fā)出綠色熒光的微管.

2.6 ATP 酶活性檢測(cè)

Kif18A 沿微管向正極移動(dòng)會(huì)水解ATP，形成ADP和磷酸根，且每水解一分子ATP 會(huì)生成一分子磷酸根，因此通過磷酸根的量可以得出被水解ATP 的量，即被水解的ATP 的量反映Kif18A 的ATP 酶活性.磷酸根在360 nm 處有自己的吸收峰，因此可以利用分光光度計(jì)測(cè)量360 nm 處的吸光度值從而得到磷酸根的量.通過磷酸根的物質(zhì)的量及其對(duì)應(yīng)的吸光度值，得到磷酸根的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖8 所示.

圖7 微管體外合成Fig.7 Microtubule synthesis in vitro

圖8 磷酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard curve of phosphate

利用純化得到的目的蛋白和體外合成的微管，進(jìn)行ATP 酶活性檢測(cè).根據(jù)加入目的蛋白后磷酸根的吸光度值，由磷酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出Kif18A 突變體蛋白水解ATP 的量，得到Kif18A 突變體蛋白的ATP 酶活性，結(jié)果如圖9 所示.

圖9 Kif18A-AA 和Kif18A-EE 的ATP 酶活性檢測(cè)Fig.9 Detection of ATPase activities of Kif18A-AA and Kif18A-EE

由圖9 可以看出，非磷酸化的Kif18A（Kif18A-AA）的ATP 酶活性進(jìn)入平臺(tái)期后數(shù)值均為3.47 nmol Pi，模擬CDK1 磷酸化后Kif18A（Kif18A-EE）的ATP 酶活性平臺(tái)期數(shù)值約為2.72 nmol Pi，即Kif18A-EE 蛋白的ATP 酶活性低于Kif18A-AA 蛋白的ATP 酶活性，表明CDK1 對(duì)Kif18A 的磷酸化修飾降低了Kif18A 的ATP酶活性.

3 討論與結(jié)論

Kinesin-8 家族在整個(gè)真核細(xì)胞有絲分裂過程中對(duì)于微管長(zhǎng)度的控制具有重要作用. Kif18A 作為Kinesin-8 家族中的一員，在微管正極末端的作用存在爭(zhēng)議：體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Kif18A 能夠作為微管解聚酶使微管的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)解聚[12]，但也有研究表明，Kif18A 不具有內(nèi)在的解聚酶活性，而是通過阻止微管蛋白加到微管末端，進(jìn)而阻止了微管的聚合和解聚[2].Kif18A 對(duì)細(xì)胞周期中的染色體整列有很大的影響.染色體整列包括中板集合與形成最薄中期板（thinnest metaphase plate）2個(gè)過程.有研究[11]報(bào)道，Kif18A 在細(xì)胞有絲分裂早期被有絲分裂蛋白激酶CDK1 磷酸化，這種修飾可以被磷酸酶PP1 去磷酸化，當(dāng)Kif18A 無(wú)法被PP1 去磷酸化時(shí)，細(xì)胞有絲分裂過程就無(wú)法形成最薄中期板.這可能是因?yàn)榱姿峄腒if18A 無(wú)法到達(dá)微管正極末端，從而無(wú)法降低微管的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性.同時(shí)Kif18A 被磷酸化后不影響中板集合的時(shí)間，但會(huì)延遲最薄中期板形成的時(shí)間，這可能是因?yàn)镃DK1 的磷酸化修飾影響了Kif18A 的運(yùn)動(dòng)能力.雖然H?fner 等[11]應(yīng)用細(xì)菌表達(dá)的Kif18A 進(jìn)行了ATP 酶活性的測(cè)定，但是由于原核細(xì)胞表達(dá)的蛋白可能不具有正常的蛋白構(gòu)象[13]，因而實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證.本研究利用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得了目的蛋白，這種真核表達(dá)系統(tǒng)能夠使目的蛋白的免疫原性、ATP 酶活性等與天然蛋白的生物活性基本相同.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Kif18A-EE 蛋白的ATP 酶活性低于Kif18A-AA 蛋白的ATP 酶活性，表明CDK1 對(duì)Kif18A 的磷酸化修飾降低了它的ATP 酶活性.這一結(jié)果預(yù)示著CDK1 的磷酸化修飾作用通過影響Kif18A 的ATP 酶活性，進(jìn)而影響其在微管上的運(yùn)動(dòng)能力，使其無(wú)法及時(shí)到達(dá)微管末端并控制最薄中期板形成的時(shí)間. CDK1 磷酸化修飾調(diào)節(jié)Kif18A 的ATP 酶活性的機(jī)制仍不清楚，是通過影響Kif18A 的結(jié)構(gòu)還是與其他蛋白的結(jié)合能力，仍需繼續(xù)深入探索.