張燕婉葉 玨時 那宋 莉孟憲敏

實驗室常用生物安全設備的使用與維護

張燕婉①葉 玨①時 那①宋 莉①孟憲敏①

為落實國家有關實驗室生物安全的法規(guī)政策，提升實驗室的管理水平，針對Ⅱ級生物安全防護醫(yī)學實驗室常用的生物安全柜、高壓滅菌器、超凈臺和通風柜等防護設備，從設備的工作原理、操作規(guī)程和檢定維護幾方面進行了闡述, 從而強調了生物安全設備安全操作和規(guī)范管理的重要性和意義，并結合自身工作介紹了經(jīng)驗與體會。

實驗室；生物安全；設備；使用；維護

實驗室常用的生物安全設備主要有：生物安全柜、高壓滅菌器、通風柜、超凈臺。國家根據(jù)實驗室對病原微生物的生物安全防護水平（BSL），并依照實驗室生物安全國家標準的規(guī)定，按操作的病原微生物危害程度從弱到強，將實驗室分為一級、二級、三級和四級。三級、四級實驗室必須經(jīng)過國家批準并通過實驗室國家認可(CNAS)，大多數(shù)實驗室屬于生物安全防護一級或二級實驗室。我們可以根據(jù)所在實驗室從事的生物實驗風險評估確定的生物安全防護級別，選擇相應的生物安全防護設備。

表1 實驗室實驗活動和生物安全的防護措施

1 生物安全柜(Biological safety cabinet,BSC)

從表1我們可以看出，從事生物實驗主要產(chǎn)生的危害是有害氣溶膠的產(chǎn)生，而生物安全柜是降低這一危害的最有效的辦法。當我們實驗的對象涉及原代培養(yǎng)物、菌毒種以及診斷性標本等具有潛在感染性材料時，都應在生物安全柜中操作。我們把具備氣流控制及高效空氣過濾裝置的操作柜稱為：生物安全柜，它能有效降低生物實驗過程中產(chǎn)生的有害氣溶膠(aerosols)對操作者和環(huán)境的危害，同時，還可以減少樣本之間由于氣溶膠產(chǎn)生的交叉污染。

1.1 生物安全柜的組成和工作原理

生物安全柜是由定向氣流（風幕）、高效過濾器（HEPA）、風機壓力系統(tǒng)和必需的在線監(jiān)測儀表組成的箱形負壓裝置[1]。其中的HEPA過濾器起著重要的過濾阻擋氣溶膠顆粒的作用。HEPA過濾器是一種一次性使用的、框架內(nèi)有多重褶迭的干性材料的過濾器，能對0.3μm氣溶膠顆粒有效過濾達99.97%，保證排出氣體和內(nèi)循環(huán)氣體的無菌狀態(tài)。圖1是Ⅱ級生物安全柜的工作原理圖：

當啟動生物安全柜時，風機開始運轉，房間內(nèi)的空氣經(jīng)前窗開口A處進入生物安全柜內(nèi)，經(jīng)進氣格柵進入風機系統(tǒng)F，鼓出的氣流從安全柜后部進入柜體上方，分成兩路。一路經(jīng)上部的HEPA過濾器排放外界（房間/管道），另一路經(jīng)HEPA過濾器E向下進入安全柜內(nèi)，經(jīng)過柜面再次經(jīng)進氣格柵進入下一個循環(huán)。這樣反復帶走污染空氣，經(jīng)過濾凈化后再進行氣體循環(huán)，確保了實驗中環(huán)境和人員不被污染。

1.2 生物安全柜的種類

目前，我國將生物安全柜分為三個等級，即Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級，它們分別有各自的特點，下邊分別進行敘述：

Ⅰ級生物安全柜：氣溶膠排放大氣前也經(jīng)HEPA過濾器過濾，但過濾后的氣體全部排放出去，柜內(nèi)沒有凈化后循環(huán)氣體。因此，這種安全柜只用于保護人員和環(huán)境不被污染，但不保護樣品。

Ⅱ級生物安全柜：氣溶膠經(jīng)HEPA過濾器過濾后，一部分排放出去，一部分再次循環(huán)進入安全柜內(nèi)，其中：前部開口區(qū)的吸入氣流用以保護操作者的安全，經(jīng)HEPA過濾的垂直氣流用以保護樣本，排出的氣流經(jīng)HEPA過濾是為了保護環(huán)境。因此，這種安全柜是真正的生物安全柜，它既保護環(huán)境、人員，也保護樣本，是目前BSL-2實驗室應用最多的生物安全柜。

表2 Ⅱ級和Ⅲ級生物安全柜的性能指標

Ⅲ級生物安全柜：為完全密閉的、不漏氣結構的通風安全柜。送入氣流經(jīng)HEPA過濾器后過濾后進入安全柜內(nèi)，排出的氣流經(jīng)雙層HEPA過濾器或過濾和焚燒兩次處理。人員通過與生物安全柜連接的密閉手套實施操作，安全柜內(nèi)維持至少120 Pa的負壓。這種安全柜適用于BSL-3實驗室，生物危險等級Ⅳ級的高致病性病原微生物的操作。

1.3生物安全柜的正確使用

1.3.1 生物安全柜的使用要求

1.3.1.2 個人防護要求：

(1) 在使用生物安全柜時必須穿個人防護服；

(2) 必須戴手套，最后戴口罩和帽子，必要時戴防護口罩或面罩（如BSL-3實驗室）；

1.3.1.3 生物安全柜內(nèi)物品的擺放原則：

(1) 潔凈區(qū)與污染區(qū)一定要嚴格分開，一般遵守從左到右為潔凈區(qū)到污染區(qū)；

(2) 所用物品盡量放在柜內(nèi)工作臺的后面，前面留出操作空間；

(3) 前面的進氣格柵要保證進氣暢通，不要被實驗物品擋住。

1.3.1.4 對紫外燈的要求：

定期更換燈管，確保紫外線的照射強度，保證殺菌效果。

1.3.1.5 避免使用明火：

明火會造成生物安全柜的氣流紊亂，干擾氣流模式，還會損壞HEPA過濾器。

1.3.1.6 實驗室內(nèi)應有備用風機和不間斷供電，確保安全柜工作時負壓不變。

1.3.2 生物安全柜使用前的準備工作

(1) 首先打開紫外燈照射30 min，消毒柜內(nèi)臺面；

(2) 關閉紫外燈，打開安全柜的風機，排走柜內(nèi)的空氣污染物，約5 min;

(3) 同時,打開日光燈，擦拭消毒安全柜的內(nèi)表面和所有要用到的物品。

1.3.3 生物安全柜的正確操作和注意事項

(1) 雙臂垂直緩慢進入安全柜前面的開口，在安全柜內(nèi)靜止等待一分鐘；

(2) 待安全柜調整完畢后，保持身體離前窗10 cm以外，在安全柜內(nèi)進行各種生物實驗操作；

(3) 操作結束后，應讓生物安全柜繼續(xù)運行至少3 min來完成柜內(nèi)空氣凈化過程。

(4) 在操作時為避免對氣流干擾，應避免胳膊在前窗開口處快速移動和頻繁進出；

(5) 廢棄物應存放在生物安全柜內(nèi)的容器中，待密閉消毒后再拿出安全柜；

(6) 在生物安全柜內(nèi)操作時，不要進行文字工作；

(7) 操作這身后盡量不要站人，更不要來回走動；

(8) 操作完畢后，應在安全柜內(nèi)對污染的手套先消毒后再脫下。

1.3.4 生物安全柜的維護

(1) 定期清潔生物安全柜：用70%醫(yī)用酒精擦拭消毒安全柜的內(nèi)壁和臺面，保持清潔；

(2) 當生物安全柜被污染時，可用：甲醛、過氧化氫熏蒸法消毒；

(3) 每年需要檢查和更換消毒用的紫外燈；

(4) 每年應更換一次HEPA過濾器，確保生物安全柜的有效性；

(5) 定期對生物安全柜進行檢定，內(nèi)容包括：

正面進氣的氣流速度，柜內(nèi)頂部向下氣流的速度，HEPA過濾器的完整性，人員、產(chǎn)品和交叉污染保護測試，柜體泄漏測試等。

2 高壓滅菌器(Pressure sterilizer)

在分子生物學實驗中工程菌的增殖、重組質粒的轉化和細胞培養(yǎng)等工作，均要求所使用的試劑、器皿和實驗用具嚴格滅菌；有害生物實驗的廢棄物的無害化處理；有的實驗還要求無核酸酶的污染，因此實驗室對實驗器械、試劑等的高壓滅菌是必不可少的。由于蒸汽獲取方法簡單、溫度高、穿透力強、無污染，因此，用蒸汽真空滅菌器作為熱力滅菌的主要生物安全設備，在生物醫(yī)學實驗室廣泛使用[2]。

消毒和滅菌的概念是不一樣的。消毒（disinfection）是指殺滅或消除傳播媒介上的病原微生物，使其數(shù)量減少到不再能引起人發(fā)病，即達到無害化處理的目的，如煮沸、巴氏消毒、紫外線照射等。滅菌(sterilization)是指不僅要殺滅和清除傳染性病原微生物，還要殺滅和清除全部微生物（如：細菌芽胞等），包括非致病性微生物，即沒有活菌存在，如：高壓蒸汽滅菌、環(huán)氧已烷滅菌等。

2.1 高壓蒸汽滅菌器的原理

將滅菌的物品放在一個密閉的壓力容器內(nèi)，通過加熱使水沸騰產(chǎn)生蒸汽（如蒸汽鍋爐），將蒸汽輸入壓力容器內(nèi),先通過熱蒸汽將容器內(nèi)的冷空氣排盡，再關閉閥門，繼續(xù)加熱。由于熱蒸汽在密閉容器中體積急劇膨脹（約1700倍），容器內(nèi)的壓力增加(室內(nèi)壓力表壓力＞0.1 MPa)，使容器內(nèi)的溫度迅速升高(沸點升高)，達到121℃以上的高溫，利用蒸汽釋放的潛熱使微生物體內(nèi)蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的[3]。

2.2 高壓滅菌器的組成和分類

壓力容器的結構主要是由:殼體(本體和封頭)、連接件、密封元件、接管、安全附件(安全閥和壓力表)和支座組成。見下圖所示：

圖1 圓桶形壓力容器的基本結構

目前普遍使用的高壓滅菌器可分為兩類：一類為下排氣式高壓滅菌器，具有溫度高、熱穿透力強、滅菌效果好優(yōu)點；另一類是抽真空脈動式真空滅菌器，屬于目前較先進的壓力容器設備,具有排出冷空氣快、滅菌時間短、對物品損壞輕、環(huán)境溫度低和自動干燥等優(yōu)點。

2.3 高壓滅菌器的安全操作

高壓滅菌器屬于一類壓力容器（0.1 MPa≤P設計＜1.6 MPa），是涉及生命安全、危險性較大的特種設備之一，國家早已頒布了有關的法規(guī)標準，如2003年國務院制定并實施的《特種設備安全監(jiān)察條例》、2000年實施的國家質量技術監(jiān)督局制定的《壓力容器安全技術監(jiān)察規(guī)程》等，明確規(guī)定了壓力容器操作人員的職責和安全管理制度,壓力容器操作人員要通過“壓力容器操作人員考核”合格后方能使用壓力容器，即持證上崗。

2.3.1 人員培訓，持證上崗

操作人員要定期參加專門的技術培訓，學習壓力容器的基本知識，熟悉國家的有關安全技術法規(guī)。了解本崗位壓力容器的結構、類別、工藝技術參數(shù)和主要技術性能。應在取得當?shù)卣跈嗟膲毫θ萜靼踩O(jiān)察機構頒發(fā)的《壓力容器操作人員合格證》資格后，才能獨立承擔壓力容器的操作。

2.3.2 規(guī)范操作

要嚴格按照“安全及工藝參數(shù)操作規(guī)程”精心操作，做好操作前各項安全檢查(本體和安全附件)和操作過程中的巡回檢查, 認真填寫運行記錄。

2.3.3 正確應對突發(fā)情況

壓力容器容器運行中,如果發(fā)生異常危及安全時，應采取緊急措施,并及時上報。

2.3.4 高壓滅菌器的操作例舉(以臥式壓力滅菌器為例)

2.3.4.1 滅菌前的準備工作

（1）檢查安全附件是否齊全、完好；

（2）本體及受壓元件有無裂紋、變形、泄漏等現(xiàn)象；

（3）各種閥門和密封元件是否完好,有無跑、冒、滴、漏和筒內(nèi)積水；

（4）快開門式壓力容器應做端蓋與筒體法蘭緊固嚙合實驗；

（5）在設備通蒸汽前壓力表的壓力應在在零位；（6）將柜室內(nèi)擦拭清潔,排氣管要暢通；

（7）將要準備滅菌的物品按要求放入金屬藍內(nèi)，要松散放置，使蒸汽能均勻作用于裝載的物品。消毒玻璃容器時，要將敞口的玻璃容器口朝下放置或平放。

2.3.4.2 滅菌操作步驟:

（1）將滅菌物品放入柜室內(nèi),關閉柜門；

（2）把蒸汽控制閥門移至“關閉”位置、截止柜室；

（3）開啟進入夾管的蒸汽閥門，將夾管內(nèi)冷氣排走；

（4）待夾管壓力表壓力達到滅菌壓力要求（一般為0.11MPa）時，把蒸汽閥轉至“消毒”位置，蒸汽進入內(nèi)，使柜室的冷氣排出；

（5）待柜室壓力達到要求時（一般為0.11 MPa），旋動調整閥保持定記錄滅菌時間；

（6）待達到滅菌時間后，把蒸汽控制閥轉至“排汽”位置，排出柜內(nèi)蒸汽；

（7）確定蒸汽排凈,表壓為“0”,將柜門打開,取出滅菌過的物品;

（8）滅菌結束，關緊進氣閥。

2.4 高壓滅菌器使用的注意事項

2.4.1 嚴禁超溫超壓運行

由于壓力容器允許使用的溫度、壓力、流量及介質充裝等參數(shù)是依據(jù)工藝設計要求和保障安全生產(chǎn)的前提下制定的，故應在設計壓力和溫度范圍內(nèi)操作，以確保安全運行。

2.4.2 應注意平穩(wěn)操作

緩慢地進行加載和卸載。操作時要做到:四慢一平穩(wěn),即慢升溫慢升壓慢降壓慢降溫,恒溫操作時工藝參數(shù)要穩(wěn)定。因為開始加壓時，過快的加載速度會降低材料的斷裂韌性，使存微小缺陷的容器在壓力的沖擊下發(fā)生脆性斷裂。

2.4.3 嚴禁帶壓操作

不帶壓松緊螺栓和維修;門關到位后才能通汽升壓,滅菌后一定要等蒸汽排凈,表壓為“0”時才能開門。

2.4.3 注意裝載容量

下排氣滅菌器的裝載量不得超過壓力容器內(nèi)容量的80%,預真空滅菌器的裝載量不得超過90%。且不能小于容器內(nèi)容量的10～5%，以防止“小裝量效應”。

2.4.4 滅菌物品盡量分類滅菌

實驗前準備消毒的物品和實驗后要滅菌的廢棄物，應分開滅菌；容易和難于滅菌的物品也應分開高壓，或以最難滅菌的物品的溫度壓力要求為準。

2.4.5 滅菌物品應按要求擺放

（1）消毒玻璃容器時，要將敞口的玻璃容器口朝下放置或平放;

（2）消毒有包裝材料的物品時，應用自動啟閉式或帶氣孔的器具裝放，以保證物品內(nèi)部空氣的排出和蒸汽的進入;

（3）消毒器皿時，盡量單獨包裝，蓋要打開，以利蒸汽滲入；

（4）難于滅菌的物品、織物包放上層，較易滅菌的物品、金屬物品放下層，不要靠門和四壁擺放物品，以防吸入較多的冷凝水。

2.4.6 廢棄物滅菌前的消毒：

大多數(shù)生物實驗室（Ⅰ、Ⅱ級）,使用脈動真空滅菌器，滅菌前隨著冷空氣的排放會有沒有消毒滅菌的熱蒸汽排出，導致容器中內(nèi)氣溶膠隨蒸汽向周圍環(huán)境擴散。如果滅菌物品是污染過有害病原微生物，這時會在滅菌器周圍會產(chǎn)生有害氣溶膠，污染環(huán)境，威脅人的健康。故在對有害廢棄物滅菌前，應對污染過的物品先進行消毒即無害化處理，如用含氯消毒液的浸泡等。

2.4.7 根據(jù)滅菌消毒物品的不同選擇不同的消毒程序

消毒液體時,排出冷空氣應選擇“置換式”,不要用“脈動式”。

2.5 滅菌器的檢定與維護

國家質量技術監(jiān)督局已有明確規(guī)定：“壓力容器的使用單位及其主管部門，必須及時安排壓力容器的定期檢驗工作，并將壓力容器年度檢驗計劃報當?shù)匕踩O(jiān)察機構及檢驗單位?！盵4]壓力容器的定期檢驗包括：外部檢驗、內(nèi)部檢驗和耐壓試驗，本文主要介紹實驗室常用的幾種滅菌器滅菌效果的監(jiān)測方法。

2.5.1 實時監(jiān)測法

指每次運行操作滅菌器時，對滅菌鍋內(nèi)、套層內(nèi)和蒸汽輸送管道內(nèi)的溫度、壓力等指標進行實時監(jiān)測，觀察滅菌設備是否達到各項性能指標，并且要對滅菌各步驟的時間進行記錄。這種監(jiān)測方法是實驗室里最經(jīng)常和最容易實施的監(jiān)測方法。

2.5.2 化學指示卡（管）監(jiān)測方法

指將既能指示蒸汽溫度，又能指示溫度持續(xù)時間的化學指示卡被滅菌的物品中央，經(jīng)一個滅菌周期后，取出指示卡，根據(jù)其顏色和性狀的改變，判斷設備是否達到滅菌效果。

2.5.3 生物監(jiān)測法

指將內(nèi)函式壓力蒸汽滅菌監(jiān)測管置于檢驗包的中心位置，經(jīng)一個滅菌周期后，取出，擠出里邊的培養(yǎng)基，按規(guī)定的時間進行培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。監(jiān)測時應設陰性對照和陽性對照，如：嗜熱脂肪芽胞菌。

2.5.4 壓力容器使用單位應在規(guī)定時間內(nèi)向當?shù)丶夹g監(jiān)督部門注冊登記,核定壓力容器的安全狀況等級。使用部門對在用容器應建立:滅菌器的檢驗、維修和報廢等技術檔案。

2.5.5 當滅菌器暫時停用時，應作好停用期間的維護工作，如：保持容器內(nèi)的清潔和干燥，防止設備受到大氣的腐蝕；清除容器內(nèi)的物品，尤其是有腐蝕性物品。

3 超凈臺(Purificatory cabinet)

超凈臺作為目前實驗室最常用的無菌操作設備廣泛應用于生物醫(yī)學實驗室。它體積小，凈化效率高，操作簡便，可有效保護實驗樣品，適用于無毒無害樣品的無菌操作。早在生物安全柜使用之前，超凈臺是當時實驗室最有效的無菌操作設備。

3.1 超凈臺的工作原理

超凈臺由三相電動機作為鼓風動力，將超凈臺周圍的空氣從超凈臺的下方的兩側面或背面鼓入，經(jīng)過上部金屬網(wǎng)內(nèi)的“超級濾清器”過濾，形成連續(xù)不斷的無塵無菌的潔凈空氣層流，即“高效的無菌空氣”，它已經(jīng)濾去了0.3μm以上的塵埃顆粒、真菌和細菌孢子等大部分微生物。潔凈的氣流從超凈臺上部送入下邊的操作臺面上，經(jīng)正面出口處排出。空氣流出速度為：30m/ min,足以阻止外部的空氣直接流入超凈臺。

3.2 超凈臺的使用注意事項

3.2.1 超凈臺操作簡便，準備時間短，打開開關運行10 min就可以進行操作，使用方便。

3.2.2 要在超凈臺內(nèi)進行接種操作時，超凈臺內(nèi)應保持清潔，凡與接種無關的物品不要放入，以保持無菌狀態(tài)。超凈臺周圍的空氣也應保持新鮮和清潔，可在通氣窗上覆上4層紗布以簡單濾塵。

3.2.3 任何時候不應將超凈臺的進風孔對著開啟的門或窗戶，以免影響濾清器的過濾效果。

3.2.4 除每次使用前應用紫外燈照射超凈臺的無菌室外，還應定期用70%的醫(yī)用酒精或2%新潔爾滅擦拭消毒臺面。

4 通風櫥(Ventilator)

通風櫥也是實驗室常用的生物安全設備，可有效將櫥內(nèi)的有毒有害的揮發(fā)性試劑排到室外，保護操作者和實驗室環(huán)境。

4.1 通風櫥的工作原理

通風櫥的設計原理很像一級生物安全柜，所不同的是沒有HEPA過濾器。通過位于通風櫥上部的一電動式鼓風機將櫥內(nèi)的空氣抽走，即外部空氣從通風櫥正面進入櫥內(nèi)，隨櫥內(nèi)氣體一同上排到管道中。

4.2 通風櫥的正確使用

4.2.1 通風櫥雖然能將大部分有害氣體排走，但由于不是密封式操作，還是會有少量有害氣體泄漏，建議在通風櫥前操作時戴上口罩、護目等。

4.2.2 如用通風櫥操作腐蝕性試劑時，應選擇用耐腐蝕材料制成的通風櫥設備，定期用清水擦拭櫥內(nèi)墻壁，保持櫥內(nèi)清潔。

以上討論了實驗室常用的幾種生物安全設備，盡管它們在生物安全防護方面起到了一定的作用，但它們也只是降低操作的風險，生物安全最重要的是實驗者自身的防護意識和規(guī)范的生物操作，僅僅靠生物安全設備的作用是不夠的。

[1]周維華.生安全柜醫(yī)藥行業(yè)標準[S]. YY0569-2005.

[2]雷東鋒. 現(xiàn)代生物化學與分子生物學儀器與設備[M].科學出版社，2006.

[3]石智豪.壓力容器安全操作技術[J].中國鍋爐壓力容器安全雜志，1989.

[4]國家質量技術監(jiān)督局.壓力容器安全技術監(jiān)察規(guī)程[J].中國鍋爐壓力容器安全雜志，2000.

Manipulation and maintenance of biological safety equipment in laboratory

Zhang Yanwan, Ye Jue, Shi Na, et al

In order to perform the state rule of biosafety and promote the managing level, this paper have discussed the several biological safety equipments such as biological safety cabinet, pressure sterilizer, purificatory cabinet and ventilator in medical laboratory (BSL-2) etc. The working principle, operating standard and maintenance of the equipments were elaborated respectively. The importance and significance on securing operation and standard management of biological safety equipment have been emphasized. This paper introduced and showed the author’s working experience and realization in combination with routine work.

Laboratory; Biosafety; Equipment; Manipulation; Maintenace

1672-8270(2010)01-0015-06

TH 772

B

張燕婉,女,(1957- ),北京大學畢業(yè)，生物化學專業(yè)，大學本科，理學學士?，F(xiàn)就職于阜外心血管病醫(yī)院中心實驗室，主任技師，主要從事儀器分析、生化分析和實驗室管理工作。

2009-11-14

①中國醫(yī)學科學院阜外心血管病醫(yī)院中心實驗室 北京 100037

China Medical Equipment, 2010, 7(1):15-20.

[First-author's address]Central Laboratory, Fuwai Hospital of Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100037, China.

近年來，我國為加強實驗室生物安全管理，減少醫(yī)學實驗室生物安全事件和感染事故的發(fā)生，政府頒布了各種有關實驗室生物安全的國家標準：GB19781-2005《醫(yī)學實驗室 安全要求》、GB19489-2008《實驗室 生物安全通用要求》、國務院令第424號《病原微生物實驗室生物安全管理條例》,使政府和廣大科研工作人員對實驗室中產(chǎn)生的生物危害有了更為深刻的認識，明確了使用生物安全防護設備（安全隔離裝置）是實驗室生物安全防護的有效措施，是保護實驗室工作人員和環(huán)境的重要手段。下表列舉了醫(yī)學生物實驗室經(jīng)常從事的實驗活動中可能發(fā)生的危害和應該使用的生物安全防護設備：見表1。