高連勝 李 陽

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DMEM培養(yǎng)基根據(jù)研究結果篩選后，選用了部分進口產(chǎn)品和國產(chǎn)產(chǎn)品相結合的方法進行，而小牛血清則全部選用國產(chǎn)產(chǎn)品。利用自制蒸餾水，在配制DMEM基礎液前再使用0.1um濾器進行過濾。

1.2 實驗條件及方法

實驗組將一支P26代CHO－C28細胞種子傳出來的90個單層轉瓶細胞按每組15瓶分成六個實驗組，即A組、B組、C組、D組、E組、F組（分組見表1）。

將每個單層瓶的細胞傳入1個三層轉瓶中，細胞生長液PH控制在6.8～7.4之間，細胞培養(yǎng)溫度為37℃恒溫，轉機轉速為8轉/h，培養(yǎng)48 h后，更換1次細胞生長液。

維持上述細胞培養(yǎng)條件，三層轉瓶細胞培養(yǎng)48小時后，將細胞生長液更換為細胞維持液。細胞維持液PH控制在6.8～7.4之間，細胞培養(yǎng)溫度為37℃，細胞培養(yǎng)轉機轉速提高到15轉/ h，細胞培養(yǎng)時間為48 h，收取細胞培養(yǎng)液。按此條件共收取20次維持液。每次收取維持液后，抽取樣品作血凝滴度試驗，檢測每組HBsAg表達量（具體結果見表3）。

2 結果與分析

2.1 結果

2.1.1 生長液階段細胞培養(yǎng)

CHO C28細胞經(jīng)單層培養(yǎng)瓶一傳一，傳入三層培養(yǎng)瓶中，使用生長液細胞培養(yǎng)8 h后，鏡下觀察細胞貼壁生長情況。其中，A組、C組、D組和F組細胞貼壁率可達85%，B組和E組細胞貼壁率約為80%。各組細胞形態(tài)以圓形、橢圓形為主，細胞排列松散，可見梭形細胞生長。

生長液細胞培養(yǎng)24 h后，鏡下觀察細胞貼壁生長情況。A組、C組、D組和F組細胞貼壁率可達95%以上，細胞排列緊密，梭形細胞均在80%以上。其中，A組和D組細胞生長情況更為良好，梭形細胞約占85%左右。B組和E組細胞貼壁率為90%左右，細胞排列較緊密，梭形細胞占在70%左右。

表1 CHO-C28細胞培養(yǎng)實驗組的分組情況

各組細胞通過不同培養(yǎng)液的培養(yǎng)后，A組、C組、D組和F組細胞生長貼壁情況、細胞形態(tài)、細胞生長速度等指標較好于B、E組的細胞（結果見表2）。

2.1.2 維持液階段細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)進入維持液階段后，各組細胞均出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，鏡下觀察細胞貼壁生長情況。其中，A組、C組、D組和F組細胞貼壁緊密，細胞成片脫落現(xiàn)象較輕。B組和E組細胞排列較緊密，細胞成片脫落現(xiàn)象嚴重。對各組作血凝滴度實驗測定HBsAg表達量（結果見表3）。

2.2 分析

由于六個實驗組的細胞是來源于一支細胞種子，且最初分組時各組細胞生長情況基本相同，同時在配制各組培養(yǎng)液時除成分不同，其他的條件均保證相同。因此，我們可以認定是細胞培養(yǎng)液中血清質量造成細胞生長培養(yǎng)過程中出現(xiàn)上述現(xiàn)象。細胞維持液階段的生長狀態(tài)與收取20次維持液的血凝滴度表明A、C、D、F組細胞脫落現(xiàn)象較輕，收取的細胞培養(yǎng)液中抗原表達量較高。其中發(fā)現(xiàn)進口DMEM與國產(chǎn)DMEM在細胞培養(yǎng)過程中，質量表現(xiàn)均非常穩(wěn)定。但從生產(chǎn)成本上考慮，選擇國內(nèi)某公司提供的DMEM作為C28細胞的基礎培養(yǎng)基。全部由國內(nèi)廠家提供的小牛血清在細胞生長液和維持液階段表現(xiàn)都很穩(wěn)定，兩種血清質量差異不明顯，能保證我們CHO-C28細胞的正常生長。

表2 生長液階段CHO-C28細胞培養(yǎng)實驗結果

表3 CHO-C28細胞培養(yǎng)維持液階段血凝滴度實驗結果

3 討論

在重組乙肝疫苗生產(chǎn)過程中，影響CHO-C28細胞HBsAg表達量的因素有很多，包括溫度、PH值、DMEM、小牛血清、蒸餾水的質量，細胞培養(yǎng)液配制時添加補充液體的比例、細胞傳代時胰酶活性及胰酶消化時間、操作人員技術熟練程度等。本文僅就DMEM、和小牛血清兩種主要原料在乙肝疫苗生產(chǎn)過程中對細胞培養(yǎng)的重要影響進行了初步實驗和分析，其他條件還有待今后進一步逐一實驗和探討。

在乙肝疫苗生產(chǎn)過程中，應對原輔料的進貨渠道嚴格把關。做到嚴格執(zhí)行SOP，保證每種原輔料的質量合格，減少批間差，確保生產(chǎn)的乙肝疫苗批批合格。

[1]金立杰，孫俊業(yè).重組CHO乙肝疫苗細胞培養(yǎng)收換液改進[J].工藝,2002(4):37-39.

[2]李玉,姚偉,張巖銳,等.重組CHO細胞培養(yǎng)過程中代謝產(chǎn)物對細胞分泌HBsAg的影響[J].醫(yī)藥生物技術,2002,9(4).

[3]孫祥明,張元興.重組CHO細胞培養(yǎng)過程中氨對細胞代謝的影響[J].2001(3).