張 瓊,伍 琴,高香玉,孔志明,李 梅(南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210093)

二溴聯(lián)苯醚對(duì)纖細(xì)裸藻的生態(tài)遺傳毒性效應(yīng)

張 瓊,伍 琴,高香玉,孔志明,李 梅*(南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210093)

通過(guò)檢測(cè)纖細(xì)裸藻生長(zhǎng)、抗氧化酶活性和單細(xì)胞凝膠電泳(彗星試驗(yàn))研究了4,4’-二溴聯(lián)苯醚(BDE-15)對(duì)纖細(xì)裸藻(Euglena gracilis)的生態(tài)遺傳毒性效應(yīng).結(jié)果表明,低濃度BDE-15(3×10-6mg/L)對(duì)纖細(xì)裸藻的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響,高濃度時(shí)(3mg/L)具有明顯的抑制作用,相比空白抑制率達(dá)69.70%;葉綠素a和類胡蘿卜素含量在高濃度BDE-15作用下顯著上升;谷胱甘肽(GSH)和細(xì)胞總蛋白含量則隨BDE-15濃度增加明顯下降;抗氧化酶系統(tǒng)中超氧化物歧化酶(SOD)活性隨BDE-15濃度升高顯著下降,具明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系,過(guò)氧化物酶(POD)活性隨BDE-15濃度增加呈上升趨勢(shì),最高濃度組(3mg/L)比空白對(duì)照提高93.45%,顯示BDE-15脅迫可誘導(dǎo)抗氧化酶活性;彗星試驗(yàn)結(jié)果顯示纖細(xì)裸藻細(xì)胞DNA損傷程度隨BDE-15濃度增加而加重,表明高濃度BDE-15具有潛在致突變性.

4,4’-二溴聯(lián)苯醚(BDE-15)；纖細(xì)裸藻；毒性效應(yīng)；彗星實(shí)驗(yàn)

Abstract：The potential ecogenotoxicities of 4, 4’-dibromodiphenyl ether (BDE-15), one of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) were investigated by detecting its effects on growth, pigment contents, antioxidant enzyme activities and DNA damage in microalgae Euglena gracilis. At lower concentrations (3×10-6mg/L), BDE-15 showed no notable effect on the growth of E. gracilis, while at higher concentration (3mg/L), the growth was restrained to 69.70% compared with the control, meanwhile the content of photosynthetic pigments increased. Glutathione (GSH) and protein contents decreased with the increase of BDE-15 concentration. In addition, there was an obvious decrease and dose-effect relationship in SOD activity with the increase of BDE-15 concentration. At higher concentration (3mg/L), POD activity increased by 93.45% compared with the control, which indicated that BDE-15 could induce the activities of antioxidant enzymes in E. gracilis. The degree of DNA damage observed from the comet assay increased with BDE-15 concentration increasing, which suggested that high dose of BDE-15 may have potential mutagenicity on E. gracilis.

Key words：BDE-15；Euglena gracilis；toxicities；comet assay

多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)是一種重要的溴代阻燃劑,在工業(yè)中應(yīng)用廣泛.PBDEs本身,以及以其阻燃的高聚物燃燒及熱裂產(chǎn)物中含有有毒、致癌、致畸的多溴代二苯并二(PBDD)和多溴代二苯并呋喃(PBDF),危害極大[1].雖然國(guó)外已逐步淘汰對(duì)PBDEs的使用,但是PBDEs仍然被廣泛用于紡織、家具、建材、交通工具和電子產(chǎn)品中,大約構(gòu)成產(chǎn)品重量的5%～30%[2].研究發(fā)現(xiàn), PBDEs在廢水、廢棄物(包括電子廢物)、沉積物、野生動(dòng)物(包括海洋哺乳動(dòng)物、魚(yú)、鳥(niǎo)和蛋等)、食品和人類(奶、血清和脂肪組織等)[3-6]均有檢出.由于PBDEs具有難降解性、環(huán)境穩(wěn)定性、高脂溶性和生物放大作用,能夠通過(guò)食物鏈的轉(zhuǎn)移,使處于高位營(yíng)養(yǎng)級(jí)的生物受到毒害,最終導(dǎo)致對(duì)人體健康的危害.PBDEs作用的靶器官主要是脂肪組織、神經(jīng)系統(tǒng)、甲狀腺和生殖發(fā)育系統(tǒng)[2,7-8]等.

水生毒理學(xué)研究中,藻類作為水體的初級(jí)生產(chǎn)者,因其個(gè)體小、繁殖快、對(duì)毒物敏感等特點(diǎn),成為監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)水環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo)[9-10].而以藻類為研究對(duì)象的PBDEs研究工作剛剛起步,其對(duì)藻類的毒性效應(yīng)更是少有報(bào)道.

彗星試驗(yàn)因具有快速、敏感、可靠等諸多優(yōu)點(diǎn)而得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[11],但有關(guān)微藻的彗星試驗(yàn)國(guó)內(nèi)外均鮮見(jiàn)報(bào)道.Aoyama等[12-13]認(rèn)為,彗星試驗(yàn)比同樣條件下人體淋巴細(xì)胞的反應(yīng)更加明顯.特定的酶反應(yīng)(如抗氧化酶系、乙酰膽堿脂酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等)可以指示外源化合物的毒性及其作用機(jī)理,這也是低劑量化學(xué)品生態(tài)毒理研究的有效手段之一[14].本研究采用廣泛用作水環(huán)境監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)的裸藻屬(又稱眼蟲(chóng)藻屬)藻類纖細(xì)裸藻(Euglena gracilis)作為受試生物,選擇彗星試驗(yàn)、抗氧化酶(SOD和POD)、谷胱甘肽(GSH)和光合色素作為評(píng)價(jià)指標(biāo),研究在環(huán)境中含量較高且具水溶性的4,4′-二溴聯(lián)苯醚(BDE-15)對(duì)藻類的遺傳毒性效應(yīng).

1 材料與方法

1.1微藻培養(yǎng)

纖細(xì)裸藻購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻類藻種庫(kù)(FACHB),采用Checcucci等[15]的培養(yǎng)基培養(yǎng).考慮到多溴聯(lián)苯醚的一般環(huán)境濃度及其快速的環(huán)境增長(zhǎng)速度,設(shè)置3個(gè)濃度組以評(píng)價(jià)不同情況下的毒性效應(yīng),設(shè)定濃度分別為3,3×10-2,3×10-6mg/L,每個(gè)濃度3個(gè)平行,以二甲基亞砜(DMSO)作助溶劑,并設(shè)空白(蒸餾水)和溶劑(DMSO)對(duì)照組.纖細(xì)裸藻接種濃度為1×105個(gè)/mL,置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),設(shè)置光強(qiáng)80～90μmol/(m2·s),溫度(25±1),℃光暗周期12h:12h,連續(xù)培養(yǎng)7d.每天定時(shí)搖動(dòng)并隨機(jī)移動(dòng)各瓶的位置以減少誤差.

1.2微藻生長(zhǎng)和光合色素含量測(cè)定

采用721-100型分光光度計(jì),于680nm波長(zhǎng)處,以培養(yǎng)液作空白,每天測(cè)定其吸光度,結(jié)果取3個(gè)平行的平均值.

通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)及纖細(xì)裸藻細(xì)胞液OD680值確定細(xì)胞數(shù)與吸光值之間的關(guān)系為y=(94.309×OD680+0.9114)×104,y為細(xì)胞數(shù)(個(gè)細(xì)胞/mL), r=0.999.

微藻培養(yǎng)7d后用90%丙酮提取,分別測(cè)定各組葉綠素[16]及類胡蘿卜素含量[17].

1.3粗酶液提取和酶活性測(cè)定

離心收集一定量藻液重新懸浮于適量預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(pH7.0),冰浴下超聲破碎(JY88-II型超聲細(xì)胞破碎儀,150W,5min,其間工作10s,間隙10s),4℃低溫高速離心(12000r/min,20min),取上清液做酶活性分析.可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定,黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性,過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法,谷胱甘肽(GSH)含量采用二硫代二硝基苯甲酸與巰基化合物反應(yīng)顯色測(cè)定.

酶活測(cè)定試驗(yàn)均以培養(yǎng)7d的藻液為樣品,采用南京建成生物工程公司提供的試劑盒測(cè)定,測(cè)定結(jié)果取3個(gè)平行的平均值.

1.4單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(SCGE)

彗星試驗(yàn)參照Aoyama等[12]的方法并做適當(dāng)修改.常規(guī)方法制片后將載玻片浸入現(xiàn)配的細(xì)胞裂解液(2.5mol/L NaOH,1.0mmol/L Na2-EDTA, 0.01%SDS,pH10,試驗(yàn)前加入1%體積的TritonX-100,10%DMSO),4℃避光裂解20min.堿性電泳液(pH13.0)中靜止解旋20min后,在電壓20 V、電流200mA條件下電泳20min.隨后用中性緩沖液中和,以溴化乙錠染色,每個(gè)濃度3個(gè)平行,用熒光顯微鏡(BX41,Olympus)在綠光激發(fā)下觀察并拍照.

彗星圖像分析采用CASP軟件,在評(píng)價(jià)參數(shù)中,Olive尾矩(OTM)同時(shí)反映了彗尾中DNA含量和彗尾形狀特征,是定量化DNA損傷程度的常用指標(biāo)[18].另外提供尾動(dòng)量(TM)參數(shù)作為參考指標(biāo),以便較全面反映DNA損傷情況.每張載玻片至少分析50個(gè)細(xì)胞.

1.5數(shù)據(jù)分析

采用SPSS和Origin7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,將試驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行顯著性t 檢驗(yàn),以P＜ 0.05作為顯著性依據(jù).

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1BDE-15對(duì)纖細(xì)裸藻生長(zhǎng)的影響

由圖1可見(jiàn),在設(shè)定的濃度范圍內(nèi),BDE-15濃度較低時(shí),對(duì)藻類生長(zhǎng)無(wú)顯著影響,最高濃度時(shí)(3mg/L)生長(zhǎng)受到顯著抑制,抑制率為空白對(duì)照組的69.70%(P＜0.01),溶劑對(duì)照組(DMSO)對(duì)微藻生長(zhǎng)無(wú)顯著影響.

圖1 不同濃度BDE-15下纖細(xì)裸藻生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of E. gracilis treated with different concentrations of BDE-15

2.2BDE-15對(duì)光合色素含量的影響

由圖2可見(jiàn), BDE-15對(duì)葉綠素,類胡蘿卜素均有一定的促進(jìn)作用,其中低濃度組(3×10-2mg/L)影響不大,高濃度組(3mg/L)色素含量升高顯著,與空白對(duì)照相比,葉綠素和類胡蘿卜素含量分別提高了53.34%(P＜0.05)和35.41%(P＜0.01).

圖2 不同濃度BDE-15對(duì)光合色素含量的影響Fig.2 Effects of BDE-15 on the photosynthetic pigments of E. gracilis

2.3BDE-15對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響

由圖3可見(jiàn),染毒7d后,各組蛋白質(zhì)含量均明顯降低,與空白對(duì)照相比,溶劑對(duì)照組和不同濃度BDE-15處理組蛋白含量均明顯降低,且差異顯著,其中3×10-6,3×10-2,3mg/L組蛋白含量分別為空白對(duì)照的57.12%(P＜0.05),46.88%(P＜0.001)和41.22%(P＜0.001).

圖3 BDE-15對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Protein content of E.gracilis treated with different concentrations of BDE-15

2.4BDE-15對(duì)抗氧化酶活性的影響

由圖4可見(jiàn),BDE-15染毒7d后,纖細(xì)裸藻SOD活性明顯下降,表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系.3×10-6,3×10-2mg/L組的SOD活性分別下降至對(duì)照組的47.61%和35.44%(P＜0.001),當(dāng)BDE-15濃度達(dá)到3mg/L時(shí),已檢測(cè)不到SOD活力.而POD活性則隨BDE-15濃度增加呈上升趨勢(shì),最高濃度組(3mg/L)比空白對(duì)照組POD活性提高了93.45%,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2.5BDE-15對(duì)GSH含量的影響

由圖5可見(jiàn),染毒7d后,隨BDE-15濃度升高,GSH含量明顯下降,3×10-6,3×10-2,3mg/L各組GSH含量分別比空白對(duì)照下降32.50%(P＜0.01), 54.70%(P＜0.001)和57.97%(P＜0.001).

2.6BDE-15對(duì)纖細(xì)裸藻DNA的損傷

由圖6可見(jiàn),染毒7d后,隨著B(niǎo)DE-15濃度升高,DNA損傷加重.在BDE-15濃度為3×10-6, 3×10-2,3mg/L時(shí),其OTM值分別為空白對(duì)照的2.14倍,2.09倍和6.22倍(P＜0.05).TM值分別為空白對(duì)照的1.66倍,1.67倍和4.36倍(P＜0.05).

圖4 BDE-15對(duì)SOD和POD活性的影響Fig.4 SOD and POD activitiy of E.gracilis treated with different concentrations of BDE-15

圖5 BDE-15對(duì)GSH含量的影響Fig.5 GSH content of E.gracilis treated with different concentrations of BDE-15

圖7顯示了未受損傷和嚴(yán)重?fù)p傷(3mg/L)的彗星圖片,由圖7(b)可明顯觀察到DNA的斷裂與移動(dòng),形成了明顯的彗尾.

圖6 不同濃度BDE-15對(duì)纖細(xì)裸藻DNA損傷Fig.6 Induction of DNA damage (olive tail moment) in E. gracilis following exposure to different concentrations of BDE-15

圖7 未受損傷和受損嚴(yán)重微藻的彗星圖片F(xiàn)ig.7 Typical comet image of microalgae E. gracilis cells in control and significant damage one

3 討論

光合色素是在光合作用中參與吸收、傳遞光能或原初光化學(xué)反應(yīng)的色素.植物光合色素一般包括葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類胡蘿卜素(Car).葉綠素含量作為生物生長(zhǎng)的重要生理參數(shù),表征了作物的生產(chǎn)能力,與光合特性密切相關(guān),在一定范圍內(nèi)與光合速率成正相關(guān),并可影響植物的表觀量子效率.本試驗(yàn)中BDE-15對(duì)葉綠素a與類胡蘿卜素的影響大致相同,二者均隨BDE-15濃度增加而增加,而藻類細(xì)胞密度則有下降趨勢(shì),這說(shuō)明藻類對(duì)光能的利用有較強(qiáng)的主動(dòng)性,即可以通過(guò)調(diào)節(jié)自身的光合色素而利用光能,而B(niǎo)DE-15的存在一定程度上提高了微藻細(xì)胞的光合效率,這種色素組成上的變化也可以作為一種指標(biāo)來(lái)監(jiān)測(cè)環(huán)境中有機(jī)物的污染狀況.

蛋白質(zhì)是細(xì)胞代謝的物質(zhì)基礎(chǔ).BDE-15對(duì)纖細(xì)裸藻的影響也體現(xiàn)在蛋白質(zhì)的變化.在本試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi),隨著B(niǎo)DE-15濃度增大,蛋白質(zhì)含量迅速下降.徐勤松等[19]也發(fā)現(xiàn)在0～10mg/L范圍內(nèi),隨著Cu濃度升高,黑藻植株中可溶性蛋白含量一直下降,呈顯著負(fù)相關(guān),與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似.植株體內(nèi)可溶性蛋白含量的下降可能是由于蛋白質(zhì)與-SH基結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性而降解,也可能是蛋白質(zhì)合成酶的失活或DNA轉(zhuǎn)錄翻譯途徑受阻,影響了蛋白質(zhì)的合成.造成本實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)代謝結(jié)果的具體原因有待于進(jìn)一步研究.

近年來(lái),SOD和POD作為植物體內(nèi)清除活性氧、保護(hù)植物細(xì)胞免受傷害的2種保護(hù)性酶進(jìn)行了大量研究.植物體在受到輕度環(huán)境脅迫時(shí),SOD和POD活性有所升高,以增強(qiáng)植物對(duì)活性氧的清除能力;而受到重度逆境脅迫時(shí),SOD和POD的活性又會(huì)大幅度降低,造成活性氧的積累和細(xì)胞的傷害[14],這種活性的降低是微藻細(xì)胞內(nèi)活性氧過(guò)量產(chǎn)生,導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過(guò)氧化及細(xì)胞傷害的主要原因之一[20].以上規(guī)律在本試驗(yàn)中得到證實(shí):隨著B(niǎo)DE-15濃度的升高,纖細(xì)裸藻SOD活性受到了明顯抑制,表現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系.POD活性則隨BDE-15濃度升高呈現(xiàn)一定上升趨勢(shì).可以推測(cè)即使在較低濃度BDE-15脅迫下,SOD作為微藻中抗氧化的第一道防線, 其清除能力即被削弱;而POD則仍能維持在相對(duì)較高的水平以清除活性氧.Zhang等[21]也得到類似結(jié)果.這也說(shuō)明BDE-15的加入影響了纖細(xì)裸藻的抗氧化酶系統(tǒng), SOD表現(xiàn)更為敏感.

GSH是由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)通過(guò)肽鍵縮合而成的非蛋白巰基三肽化合物,是用途廣泛的活性短肽.它是一種抗氧化劑和自由基清除劑,同時(shí)具有調(diào)節(jié)其他抗氧化劑的作用.本試驗(yàn)中,經(jīng)DMSO處理的纖細(xì)裸藻(溶劑對(duì)照組),其GSH含量相比空白對(duì)照明顯下降,說(shuō)明DMSO對(duì)藻類會(huì)產(chǎn)生一定影響,但是根據(jù)圖1 生長(zhǎng)曲線可知,這種影響在藻類的生理可調(diào)范圍之內(nèi),彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明DMSO不會(huì)帶來(lái)明顯的遺傳毒性效應(yīng).但其他濃度組GSH含量進(jìn)一步明顯下降,說(shuō)明BDE-15會(huì)對(duì)藻類的抗氧化功能造成損害,影響藻類清除自由基的能力.

彗星實(shí)驗(yàn)在毒理學(xué)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì).Olive尾矩同時(shí)反映了彗尾中DNA含量和彗尾形狀特征,能夠較好地定量DNA的損傷程度[22-23].另外提供尾動(dòng)量(TM)參數(shù)作為參考指標(biāo),從而更全面反應(yīng)DNA損傷情況.在本試驗(yàn)中,BDE-15的加入量與纖細(xì)裸藻DNA分子損傷程度表現(xiàn)出較為明顯的相關(guān)性,可以作為檢測(cè)BDE-15遺傳毒性的重要指標(biāo)與依據(jù).

4 結(jié)論

4.1低濃度BDE-15(3×10-6mg/L)對(duì)纖細(xì)裸藻的生長(zhǎng)影響不顯著,但已經(jīng)可以引起細(xì)胞的氧化損傷,產(chǎn)生了一定程度的過(guò)氧化作用,造成細(xì)胞中總可溶蛋白含量、GSH含量及抗氧化酶活性下降.4.2高濃度的BDE-15(3mg/L)導(dǎo)致了纖細(xì)裸藻細(xì)胞色素含量的增加,蛋白質(zhì)和GSH濃度以及SOD活性明顯下降,表現(xiàn)出很強(qiáng)的氧化脅迫效應(yīng).其中SOD表現(xiàn)最為敏感.

4.3彗星試驗(yàn)結(jié)果顯示,低濃度BDE-15即可引起纖細(xì)裸藻DNA的明顯損傷,且損傷程度隨BDE-15濃度增加而加重,說(shuō)明高濃度BDE-15具有較為明顯的遺傳毒性效應(yīng).

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Ecogenotoxicological effects of BDE-15 on the Microalga Euglena gracilis.

ZHANG Qiong, WU Qin, GAO Xiang-yu, KONG Zhi-ming, LI Mei*(State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of Environment, Nanjing University, Nanjing 210093, China). China Environmental Science, 2010,30(6)：833～838

X503

A

1000-6923(2010)06-0833-06

張 瓊(1987-),女,回族,安徽省桐城市人,南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院碩士研究生.主要從事環(huán)境毒理學(xué)方向研究.

2009-11-02

江蘇省社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(BS2007049);國(guó)家“973”項(xiàng)目(2008CB418003)

* 責(zé)任作者, 副教授, meili@nju.edu.cn