趙京生，繆應(yīng)業(yè)，李 浩，易偉國(guó)，李玉玲

前列腺癌是歐美國(guó)家重要的男性腫瘤疾病，目前美國(guó)前列腺癌的病死率已超過(guò)肺癌，成為第一位的危害男性健康的腫瘤疾病，前列腺癌在我國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。目前臨床上治療前列腺癌的藥物有5-氟尿嘧啶（5-FU）等藥物，5-FU為嘧啶類氟化物，屬于抗代謝腫瘤藥，對(duì)增殖性細(xì)胞均有殺傷性作用。研究發(fā)現(xiàn)5-FU細(xì)胞毒性作用迅速減弱,且大多存在耐藥性。本研究利用KDR siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3，研究其對(duì)耐藥細(xì)胞藥物敏感性的影響，為前列腺癌的治療提供新方法。

1 材料和方法

1.1 材料 pSilencerTM3.1-H1 neo質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)

Ambion公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PC3細(xì)胞株為本室保存；小牛血清為杭州四季青公司；四氮唑鹽 （MTT）為美國(guó)Amresco公司；G418為北京賽泰克公司產(chǎn)品；5-FU為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 siRNA靶序列的設(shè)計(jì)、質(zhì)粒重組、轉(zhuǎn)化、測(cè)序與純化 見文獻(xiàn)[1]。

1.3 siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞 提取測(cè)序正確的siRNA表達(dá)載體并測(cè)定濃度。將PC3細(xì)胞按1×105/孔的數(shù)量轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板，siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞按操作說(shuō)明進(jìn)行，每孔質(zhì)粒用量為2 μg，脂質(zhì)體用量為 5 μl。

1.3.1 siRNA轉(zhuǎn)染后PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線 轉(zhuǎn)染后 24 h，消化下各孔PC3細(xì)胞，按5×103/孔的數(shù)量轉(zhuǎn)種于 96 孔板，設(shè) 6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（24、36、48、60、72、84 h），每點(diǎn)4孔，培養(yǎng)至各時(shí)間點(diǎn)，MTT法檢測(cè)吸光度 （A）值。以未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒pSilencer3.1-NC的PC3細(xì)胞為對(duì)照。

1.3.2 細(xì)胞周期測(cè)定 收集轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞，加預(yù)冷的無(wú)水乙醇快速混勻（終濃度為60%～70%）4℃固定1 h；PBS洗滌2次，每次加洗液2.5 ml左右， 離心半徑 8 cm，1000×g離心 5 min； 加100 μl PBS調(diào)整細(xì)胞濃度，每份樣品為8×105個(gè)細(xì)胞；加入1 ml PI染色液，室溫下避光染色30 min；300目濾網(wǎng)過(guò)濾于流式細(xì)胞分析樣品管，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA-PI的熒光強(qiáng)度，結(jié)果采用Modit軟件系統(tǒng)進(jìn)行析。以未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒pSilencer3.1-NC的PC3細(xì)胞為對(duì)照。

1.3.3 陽(yáng)性克隆篩選 轉(zhuǎn)染48 h后按1∶12比例稀釋細(xì)胞傳代培養(yǎng)，加G418（500 mg/ml）篩選陽(yáng)性克隆，1次/3 d換含抗生素的培養(yǎng)基。14 d后加G418（500 mg/ml）維持陽(yáng)性克隆，收集細(xì)胞分析。

1.4 MTT法檢測(cè) 用于檢測(cè)KDR干擾前后5-FU細(xì)胞毒性作用的變化。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期三組細(xì)胞（pSilencer3.1-KDR、pSilencer3.1-NC 和 PC3）接種于96孔板，每孔種5.0×103個(gè)細(xì)胞，接種后24 h每孔加入含不同濃度5-FU，5-FU濃度序列為0.00、1.00 ×102、5.00 ×102、2.50 ×103、1.25 ×104、6.25 ×104、3.13×105、1.56×106nmol/L。培養(yǎng) 48 h 后加 5 g/L MTT 20 μl/孔（調(diào)零孔除外），繼續(xù) 37℃孵育 4 h后，吸取上清液加DMSO 150 μl/孔，紫色結(jié)晶完全溶解后，在酶聯(lián)免疫儀570 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度A值。按公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率（IR）：IR（%）=（1-實(shí)驗(yàn)孔 A 均值/對(duì)照孔均值）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 KDR siRNA抑制PC3細(xì)胞的生長(zhǎng) 與pSilencer3.1-NC和 PC3對(duì)照組相比，pSilencer3.1-KDR組轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯變慢（圖1）。

圖 1 轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.2 KDR siRNA對(duì)PC3細(xì)胞周期的影響 pSilencer 3.1-KDR組G0/G1期細(xì)胞數(shù)較未轉(zhuǎn)染組增加了18.33%，較pSilencer 3.1-NC組增加了11.41%（P＜0.01）；進(jìn)入S期和G2、M期的細(xì)胞數(shù)較未轉(zhuǎn)染組分別減少了12.07%和6.26%，較pSilencer 3.1-NC 組減少了 8.21%和 3.2%（P＜0.01，表 1）。

表 1 各增殖周期PC3細(xì)胞（±s，%）

表 1 各增殖周期PC3細(xì)胞（±s，%）

與其余組比較，*P＜0.01

組別 G0/G1 S G2、M未轉(zhuǎn)染 65.52±2.61 27.05±1.83 7.43±0.75 pSilencer 3.1-NC 72.44±2.85 23.19±1.78 4.37±0.42 pSilencer 3.1-KDR 83.85±2.41* 14.98±1.36* 1.17±0.21*

2.3 KDR siRNA聯(lián)合5-FU對(duì)PC3細(xì)胞藥物敏感性的影響 5-FU IC50值在pSilencer 3.1-KDR組為 （898.34±44.34） nmol/L， 顯 著 低 于 PC3 和pSilencer3.1-NC 組的 （1 692.30±87.33）nmol/L 和（1 688±86.41） nmol/L（P<0.01）。 后兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

VEGF與其受體在腫瘤血管形成中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[2，3]，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，誘導(dǎo)血管生成，有助于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。VEGFR家族的成員包括：VEGFR1（Flt-1）、VEGFR2（KDR/Flk-1）、VEGFR3（Flt-4）。 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體Ⅱ，又稱激酶功能區(qū)受體 （vascular endothelial growth factor Ⅱ，VEGFR2/kinase domain receptor，KDR），KDR是發(fā)揮功能的主要受體，KDR不僅表達(dá)于腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞而且表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞膜和（或）胞質(zhì)，提示腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF不僅以旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞并誘導(dǎo)血管新生，也可通過(guò)自分泌途徑與自身表面的受體結(jié)合而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或遷移、抑制細(xì)胞凋亡。研究表明，人前列腺癌細(xì)胞中有VEGF和KDR表達(dá)，存在VEGFKDR自分泌途徑，與前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4,5]。阻斷VEGF與KDR的相互作用就能抑制動(dòng)物體內(nèi)實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，達(dá)到治療腫瘤、抑制腫瘤生長(zhǎng)的目。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是指雙鏈RNA介導(dǎo)的、序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過(guò)程。它作為新興的基因阻斷技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于基因功能及基因治療的相關(guān)研究。

KDR siRNA表達(dá)質(zhì)粒pSilencer 3.1-KDR轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞后，抑制PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度明顯變慢；對(duì)PC3細(xì)胞周期的影響：pSilencer 3.1-KDR組G0/G1期細(xì)胞數(shù)較未轉(zhuǎn)染組增加了18.33%，較 pSilencer 3.1-NC 組增加了 11.41%（P＜0.01）；進(jìn)入S期和G2、M期的細(xì)胞數(shù)較未轉(zhuǎn)染組分別減少了12.07%和6.26%，較pSilencer 3.1-NC組減少了8.21%和 3.2%（P＜0.01）。

5-FU是影響核酸生物合成的藥物，是抗代謝藥物之一。這類藥物模擬正常代謝物質(zhì)，如葉酸、嘌呤堿、嘧啶堿等的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞周期S期與有關(guān)代謝物質(zhì)發(fā)生特異性的拮抗作用，從而干擾核酸，尤其是DNA的生物合成，阻止瘤細(xì)胞的分裂繁殖。本實(shí)驗(yàn)中用pSilencer 3.1-KDR轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，以 IC50（50%inhibition concentration）來(lái)表示前列腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。IC50越小，表示腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性越大；反之則表示敏感性越小。結(jié)果，KDR siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的IC50明顯降低，對(duì)5-FU的敏感性增加（P<0.01）。提示化療藥物與KDR siRNA聯(lián)合用藥，既可以提高療效，還可以降低抗癌藥物使用劑量，有助于克服單用化療藥所引起的不良反應(yīng)大的缺點(diǎn)，并有助于解決單用siRNA治療難以完全抑制腫瘤的生長(zhǎng)且成本較高等問(wèn)題。

總而言之，KDR siRNA能夠具有選抑制PC3細(xì)胞增長(zhǎng)，可將更多的細(xì)胞阻滯在G0～G1期，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖。RNAi作為有效治療方法為癌癥提供一種潛在的治療方式。因此，本研究也可能為前列腺癌提供一種潛在的治療方法，即將基因治療與化療藥物相結(jié)合，以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物的敏感性，降低化療藥物的臨床用量，減少藥物的不良反應(yīng)。

[1]繆應(yīng)業(yè)，劉 新，李 浩.siRNA沉默PC-3細(xì)胞中KDR基因的表達(dá). 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（19）：1733.

[2]Suhardja A,Hoffman H.Role of growth factors and their receptors in proliferation of microvascular endothelial cells[J].Microsc Res Tech,2003,60(1):70.

[3]Underiner TL，Ruggeri B，Gingrich DE.Development of vascular endothelial growth factor receptor(VEGFR)kinase inhibitors as anti-angiogenic agents in cancer therapy[J].Curr Med Chem,2004,11(6):731.

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[5]Ferrer FA,Miller LJ,Andrawis RI,et al.Angiogenesis and prostate cancer:in vivo and in vitro expression of angiogenesis factors by prostate cancer cells[J].Urology,1998,51(1):161.