張可鋒,朱華,高雅,鄒登峰(.桂林醫(yī)學(xué)院,桂林市54004;.廣西中醫(yī)學(xué)院,南寧市53000)
狗肝菜為爵床科植物狗肝菜Dicliptera chinensis(L.)Nees的全草,其味苦、性寒,具有清熱、涼血、利尿、解毒等功效,臨床常用于治療熱病斑疹、便血、溺血、小便不利、腫毒疔瘡等證。有文獻(xiàn)報(bào)道,狗肝菜主要含有多糖、有機(jī)酸、氨基酸等物質(zhì)[1],其中多糖具有保肝降酶的活性[2],但對(duì)狗肝菜多糖的提取工藝研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究采用單因素和L9(34)正交試驗(yàn)法考察提取時(shí)間、溫度、次數(shù)和料液比對(duì)狗肝菜多糖得率的影響,以期為狗肝菜活性成分的進(jìn)一步研究與資源應(yīng)用提供理論依據(jù)。
UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)。狗肝菜藥材采自廣西中醫(yī)學(xué)院藥用植物園,經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院藥用植物教研室韋松基教授鑒定為真品。葡萄糖(廣東汕頭市西隴化工廠,批號(hào):0703151);苯酚、硫酸、乙醇、石油醚(30~60℃)、丙酮、乙醚及其余試劑均為分析純。
稱取干燥的狗肝菜全草粗粉100 g,加入適量石油醚脫脂,無水乙醇除雜,各回流提取2 h。藥渣揮盡乙醇后沸水提取2次,每次1.5 h,合并提取液,濃縮至100 mL,氯仿-正丁醇(4∶1)多次萃取(即Sevag法),除去蛋白質(zhì),加95%乙醇使醇含量達(dá)到80%,于4℃冰箱中醇沉12 h。抽濾,濾渣依次用乙醚、無水乙醇、丙酮洗滌,即得狗肝菜多糖。
精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖250 mg,蒸餾水溶解后定容至100 mL。準(zhǔn)確吸取此溶液1 mL,置于25 mL量瓶中 ,稀釋至刻度,搖勻(含葡萄糖100 μg·mL-1),備用。
分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL,置于具塞試管中,用蒸餾水補(bǔ)充至2 mL,以蒸餾水作空白,每管加入5%苯酚溶液1 mL,再垂直快速加入濃硫酸5 mL,搖勻,放置10 min,沸水加熱15 min,之后用流水速冷至室溫,于487 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)。以檢測(cè)濃度(C)為橫坐標(biāo),A為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為A=0.007 74C+0.036 38(r= 0.999 4)。結(jié)果表明,狗肝菜多糖檢測(cè)濃度在20~70 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。
準(zhǔn)確稱取多糖20 mg,溶于100 mL容量瓶中,稀釋至刻度,搖勻。準(zhǔn)確吸取此溶液1 mL,置于具塞試管中,按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖溶液中葡萄糖的濃度,按下式計(jì)算出換算因子:f=W/(C·D)。式中,W為多糖質(zhì)量(mg);C為多糖濃度(μg·mL-1);D為稀釋倍數(shù)。
準(zhǔn)確稱取生藥狗肝菜1 g,以石油醚脫脂,水煎煮法提取,醇沉、減壓干燥,按“2.9”項(xiàng)下方法提取操作。精密稱定各提取物質(zhì)量20 mg,然后加水定容至250 mL,作為樣品溶液。
精密吸取供試品溶液2 mL,置于具塞試管中,按苯酚-濃硫酸法,照“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,由回歸方程計(jì)算供試品溶液中葡萄糖濃度,按公式:含量(%)=(C?D?f/W)×100%,計(jì)算供試品中多糖的含量;多糖得率(%)=多糖含量×干燥提取物質(zhì)量(g)/原料質(zhì)量(g)。其中,C為樣品液中葡萄糖的濃度;D為稀釋因素;f為換算因子;W為樣品質(zhì)量。
精密稱取6份空白基質(zhì)各5 g,分別加入精制多糖10 mg,按“2.5”項(xiàng)下供試品溶液的方法制備和“2.3”項(xiàng)方法操作測(cè)定,測(cè)定吸光度,計(jì)算加樣回收率和RSD,結(jié)果分別為98.58%、2.19%。
取樣品液2 mL,按“2.3”項(xiàng)方法測(cè)定5次,測(cè)定吸光度,結(jié)果RSD=0.51%。
2.9.1 單因素分析試驗(yàn) (1)提取時(shí)間對(duì)狗肝菜多糖得率的影響:以料液比1∶15、溫度90℃,提取2次,用85%的乙醇沉淀,不同的提取時(shí)間(1、1.5、2.0、2.5 h)多糖得率分別為2.30%、2.62、2.86%、2.87%??梢娞崛?.0 h多糖得率相對(duì)較高,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),多糖得率不再增加,考慮其狗肝菜中多糖的含量是一定的,在其它條件不變下延長(zhǎng)時(shí)間狗肝菜藥材中一些其它的成分會(huì)被提取出來,干擾多糖的檢測(cè)結(jié)果。(2)提取次數(shù)對(duì)狗肝菜多糖得率的影響:選擇不同提取次數(shù)(1、2、3),以1∶15的料液比,在90℃下提取2.0 h,用85%的乙醇沉淀,多糖得率分別為2.70%、2.98%、3.01%。可見,提取3次多糖的得率相對(duì)較高,但提取2次和3次得率相差不多,從工藝及操作上考慮選擇提取2次。(3)提取溫度對(duì)多糖得率的影響:以料液比1∶15,提取2次,每次2.0 h,用85%的乙醇沉淀,不同的提取溫度(80、85、90、95℃)多糖得率分別為2.80%、2.83%、2.85%、2.86%??梢娞崛囟?0℃多糖得率相對(duì)較高,隨著溫度升高,多糖得率不再增加。(4)料液比對(duì)狗肝菜多糖得率的影響:選擇不同的料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25),溫度為 90 ℃,提取2次,每次2.0 h,用85%的乙醇沉淀,結(jié)果多糖得率分別為2.72%、2.81%、2.84%、2.86%??梢婋S著料液比增大,多糖得率不斷增加,在料液比1∶20以上時(shí),多糖得率增加緩慢。(5)醇沉濃度對(duì)狗肝菜多糖得率的影響:以1∶20的料液比,在90℃下提取2次,每次2 h,選擇不同醇沉濃度(80%、85%、90%),結(jié)果多糖得率分別為3.08%、3.10%、3.10%??梢?0%以上乙醇對(duì)狗肝菜多糖沉淀度影響不大??紤]節(jié)省原料,在工藝中選擇80%的乙醇沉淀即可。
2.9.2 正交試驗(yàn) 通過對(duì)提取時(shí)間、溫度、次數(shù)、料液比和醇沉濃度這5個(gè)因素進(jìn)行分析,根據(jù)單因素分析結(jié)果,從中選取提取時(shí)間(A)、提取次數(shù)(B)、提取溫度(C)、料液比(D)4個(gè)因素,采用L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn),以狗肝菜多糖得率為指標(biāo)確定最佳提取工藝。因素水平見表1;正交試驗(yàn)結(jié)果見表2;方差分析結(jié)果見表3。
表1 因素水平Tab 1 Factors and levels
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal test
表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis
由表2、表3可知,影響因素的主次順序?yàn)锳>D>B>C,C為非主要因素,考慮能源,選擇提取溫度為85℃,故狗肝菜多糖最佳提取工藝為A3B2C1D3,即提取時(shí)間2 h,提取2次,溫度85 ℃,料液比1∶20。
2.9.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按正交試驗(yàn)的優(yōu)化條件對(duì)3批狗肝菜藥材進(jìn)行提取工藝驗(yàn)證,結(jié)果多糖含量和得率的平均值分別為(5.12±0.11)%和(3.26±0.3)%。3次差異較小,工藝穩(wěn)定。
本文測(cè)定多糖含量方法的原理是先用無水乙醇除去單糖、低聚糖及其它干擾性成分,再用水提醇沉法得到多糖。多糖在濃硫酸的作用下水解成單糖,并迅速脫水生成糖醛衍生物,然后和苯酚縮合成橙黃色化合物,且顏色穩(wěn)定,該化合物顏色深淺與糖的濃度成正比。因狗肝菜采收產(chǎn)地、季節(jié)等因素,其多糖含量會(huì)有差異,但多糖含量可作為其質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。此外,今后應(yīng)加強(qiáng)以多糖為活性成分的藥理實(shí)驗(yàn)研究。
由于多糖在空氣中易氧化使顏色加深,故在過濾過程中分別依次用乙醚、無水乙醇、丙酮多次洗滌,消除了這種變化,而后真空干燥可得狗肝菜多糖。
[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,1977:1 424.
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