桂亞萍，鄭 惠，沃 琤，孔令和

(九江市第三人民醫(yī)院，江西 九江 332000)

九江地區(qū)丙型肝炎病毒基因分型

桂亞萍，鄭 惠，沃 琤，孔令和

(九江市第三人民醫(yī)院，江西 九江 332000)

丙型肝炎病毒；反向點(diǎn)雜交；基因分型

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是引起輸血后非甲非乙型肝炎的主要病原分子。HCV是小的有包膜的單股正鏈RNA病毒，屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬，顆粒大致呈球形，直徑約50nm，基因全長(zhǎng)約9400個(gè)核苷酸。由于RNA復(fù)制酶的低保真性和缺乏校正功能，使HCV呈高度異質(zhì)性。根據(jù)HCV的核苷酸序列的差異，可將HCV分成1～6型及不同亞型(以a，b，c等表示)[1]。HCV的基因型及基因亞型的分布具有一定的區(qū)域性，不同的基因型及基因亞型所致肝病的嚴(yán)重程度以及對(duì)干擾素的治療反應(yīng)及用藥療程都不同[2，3]。因此，有必要在治療前先給予HCV的基因分型檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)的結(jié)果制定治療方案和療程。本研究旨在了解九江地區(qū)HVCRNA陽(yáng)性感染者的基因分型分布，以指導(dǎo)臨床治療及預(yù)后的判斷。

1 材料與方法

1.1 一般資料 試驗(yàn)組為江西省九江市第三人民醫(yī)院院門診及住院患者，HCV-RNA均＞5.0×104拷貝/m l共55例，其中男41例，女14例，有輸血史43例，年齡22～65歲(平均年齡42歲)。對(duì)照組10例，為健康體檢者血清標(biāo)本。

1.2 試劑HCV-RNA核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒、丙型肝炎病毒基因分型反向點(diǎn)雜交(PCR-RDB)檢測(cè)試劑盒：均由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。自備試劑：氯仿、異丙醇、75%乙醇。

1.3 儀器 美國(guó)ABI-7300熒光定量PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)ABI2720型PCR定性擴(kuò)增儀，美國(guó)BECKMAN COULTER 64R型低溫高速離心機(jī)，DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽，BENQ 5000S掃描儀等。

1.4 方法

1.4.1 HCV-RNA-PCR熒光定量檢測(cè) 嚴(yán)格按照HCV-RNA核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行操作，(1)RNA提??；(2)逆轉(zhuǎn)錄；(3)PCR擴(kuò)增及熒光定量檢測(cè)；(4)對(duì)HCV-RNA含量≥5×104拷貝/ml的陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行基因分型檢測(cè)。

1.4.2 HCVRNA基因分型檢測(cè) 按照丙型肝炎病毒基因分型反向點(diǎn)雜交檢測(cè)嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行操作：(1)RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄；(2)PCR擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行，反向點(diǎn)雜交與顯色。

2 結(jié)果

HCV基因分型反向點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果；對(duì)55例HCV-RNA含量≥5.0×104拷貝/m l的標(biāo)本及10例健康體檢者進(jìn)行基因分型反向點(diǎn)雜交檢測(cè)。熒光定量PCR檢測(cè)HCV-RNA陽(yáng)性的55例標(biāo)本其不同基因分型具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 HCV基因分型結(jié)果

3 討論

HCV基因型別的分布與地域有很大關(guān)系。HCV1b和2a基因型在我國(guó)較為常見(jiàn)。其中以1b型為主，某些地區(qū)有1a、2b和3b型報(bào)道，6a型主要見(jiàn)于香港和澳門地區(qū)，在南方邊境省份也可見(jiàn)基因6型[1]。本文檢測(cè)55例HCV–RNA≥104拷貝/ml陽(yáng)性標(biāo)本結(jié)果顯示HCV1b型35例占63.6%，2a型6例占10.9%，6a型12例占21.8%,另檢出兩例3b型。結(jié)果顯示九江地區(qū)丙型肝炎基因型以1b為主，6a次之，并有少數(shù)的2a和3b型。

本文利用PCR反向點(diǎn)雜交法，檢測(cè)熒光定量PCR HCV-RNA陽(yáng)性的標(biāo)本符合率為100%。10例健康體檢者對(duì)照者血清HCV-RNA熒光定量及PCR HCV-RNA點(diǎn)反雜交檢測(cè)結(jié)果均為陰性，陰性符合率為100%。說(shuō)明PCR反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)HCV-RNA基因型結(jié)果可靠。具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),而且簡(jiǎn)便、快速，不需熒光標(biāo)記和專用的熒光掃描儀。

HCV是一種全球性傳染的、給人類健康帶來(lái)極大威脅的病原體，是引起人類慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原之一[4]。HCV基因分型對(duì)于流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷、治療方案的選擇和預(yù)后的判斷以及丙型肝炎發(fā)病機(jī)制的研究都有重要意義。國(guó)內(nèi)外研究表明，HCV不同的基因型對(duì)肝臟損傷的程度不同，1b型對(duì)肝臟的損傷要比其他型嚴(yán)重得多[5]。HCV對(duì)干擾素的應(yīng)答率也不同，Kandi等[6]報(bào)道HCV1b型感染多為慢性活動(dòng)性肝炎，易進(jìn)展至肝硬化甚至肝癌，對(duì)干擾素治療應(yīng)答率低療程要足夠長(zhǎng)，2a型等比1b型對(duì)干擾素敏感。綜上所述，HCV基因型與肝病的嚴(yán)重程度有著密切關(guān)系，并且影響著干擾素的抗病毒治療的療效，HCV基因分型檢測(cè)可為臨床診斷和治療提供重要的依據(jù)，因此，對(duì)慢性丙型肝炎患者在抗病毒治療前有必要先進(jìn)行基因分型的檢測(cè)，以指導(dǎo)臨床醫(yī)師制定用藥療程方案及預(yù)測(cè)療效。

[1]丙型肝炎防治指南.中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì),2004:3.

[2]唐小平,吳婉芬,袁小珍.丙型肝炎病毒基因分型及其與疾病程度、感染途徑和干擾素療效的關(guān)系 [J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 1999,22:8-11.

[3]蘇英豪.丙型肝炎病毒基因分型及其意義[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)微生物學(xué)分冊(cè),1999,17:92-95.

[4]莊 輝.重視丙型肝炎的研究[J].中華肝臟病雜志,2004,12(2):65.

[5]蔣偉倫,顧士民,胡蕓文,等.上海地區(qū)丙型肝炎病毒基因分型的研究[J].中華肝臟病雜志,1999,7:115.

[6]Kandi K,Kako M,Okamoto H.HCV genotypes in chronic hepatitis C and response[J].Lancet,1992,339:1543.

R373.2,R512.6+3,Q754

B

1674-1129(2010)05-0514-01

10.3969/j.issn.1674-1129.2010.05.042