張少敏，陳文芬，趙謀明

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

響應(yīng)面法優(yōu)化桃金娘色素的提取工藝

張少敏，陳文芬，趙謀明*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

為得到桃金娘果實(shí)色素的最佳提取工藝條件，采用全波長(zhǎng)掃描得出桃金娘色素的最大吸收波長(zhǎng)和最佳提取劑及其最佳pH，在此基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間(A)、提取劑體積分?jǐn)?shù)(B)、液料比例(C)、提取溫度(D)為單因素考察因子，以最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面對(duì)其提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，pH為1.0的酸化乙醇為桃金娘色素的最佳提取溶劑，且最大吸收峰λmax為520nm，響應(yīng)面分析得到四個(gè)因素的最佳組合為:提取時(shí)間3.56h，乙醇濃度54.55%，液料比22.36mL/g，溫度64.78℃，在該條件下色素理論最大提取值為0.6070，實(shí)際驗(yàn)證值為0.6177，兩者誤差較小，表明該條件組合較好。

桃金娘，色素，響應(yīng)面，吸光值

Abstract:In order to get the optimal extraction conditions of Rhodomyrtus tomentosa pigment，full wavelength scanning was used to obtain the maximum absorption wavelength and the optimal pH of the extraction agent.The effects of extraction time，volume fraction of alcohol，material-solvent ratio and extraction temperature on absorbance were studied.Based on the single factor test，the absorbance at the maximum absorption peak as index，response surface method was used to optimize its technique parameters.The optimal condition showed as follows:the optimal extractant was acidified ethanol with pH1.0，the maximum absorption wavelength was 520nm.The optimized extraction parameters were extraction time 3.56h，54.55%(volume fraction)alcohol condition，material-solvent ratio 1∶22.36 and extraction temperature 64.78℃.Under the optimal conditions，the absorbance at the maximum absorption wavelength of pigment extract was 0.6070，the actual verification value was 0.6177 which had less errors compared with the predicted value.

Key words:Rhodomyrtus tomentosa;pigment;response surface methodology;absorbance

大多天然色素色澤純正，安全性高，有些對(duì)人體還有一定的保健作用［1］，天然色素的研究與開發(fā)已成為國(guó)內(nèi)外食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。國(guó)外的食品著色劑正逐步向以天然色素為主，合成色素為輔的方向發(fā)展。我國(guó)的天然食用色素研究起步相對(duì)較晚，目前尚處于天然色素與合成色素并存的狀況，但我國(guó)已把開發(fā)天然食用色素作為發(fā)展食品添加劑的一個(gè)重要方向［2］。桃金娘為桃金娘科藥用植物，又稱稔子、山稔，主要分布于我國(guó)南方各省，桃金娘的果實(shí)完全成熟時(shí)味甜，略有澀味，汁液呈誘人的紫紅色，富含多糖、蛋白質(zhì)、單寧、黃酮類、花青素、萜類化合物、氨基酸、微量元素和維生素等多類化學(xué)成分［3-4］，且有研究表明其對(duì)化膿鏈球菌具有抑制作用［5］，是一種難得的藥膳同源新資源，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。目前對(duì)于桃金娘的開發(fā)利用主要集中在醫(yī)藥、植物資源、生態(tài)學(xué)［6］等領(lǐng)域，食品領(lǐng)域中對(duì)桃金娘果實(shí)在飲料［7-8］方面的研究較多，對(duì)其果實(shí)中的色素研究很少，而桃金娘色素具有色澤鮮亮，無毒，無異味等優(yōu)點(diǎn)，并兼有多種營(yíng)養(yǎng)成分，符合現(xiàn)代人對(duì)健康、安全理念的要求，具有廣闊的開發(fā)前景。本研究在確定桃金娘色素最大吸收波長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了桃金娘色素的提取工藝，為對(duì)其深入研究和開發(fā)應(yīng)用提供了指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全熟的桃金娘果實(shí) 采于廣東茂名，干燥粉碎后經(jīng)80目過篩，裝于封口袋密封待用;無水乙醇、乙酸乙酯、甲醇、石油醚、濃鹽酸等 均為分析純。

SHZ-82A恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;pHS-25數(shù)顯pH計(jì) 上海精密儀器有限公司;UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司;UV-2100紫外可見分光光度計(jì) 尤尼科(上海)儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色素測(cè)定方法 我國(guó)食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)建議采用比吸光度表示色素含量［9］。

式中:A為樣品稀釋至100mL時(shí)，用1cm比色皿測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度;m為樣品質(zhì)量，g。

由上式可以看出，當(dāng)樣品質(zhì)量相同時(shí)，色素的比吸光度與吸光度成正比，在本實(shí)驗(yàn)中，樣品質(zhì)量相同，所以為了方便起見直接用吸光度值(A)分析比較不同提取條件下色素的提取效果。

1.2.2 桃金娘色素的提取工藝 桃金娘果實(shí)干品→粉碎→過篩(80目)→提取→離心(8000r/min)→抽濾→定容→測(cè)定吸光值

1.2.3 提取劑的選擇及最大波長(zhǎng)的確定 準(zhǔn)確稱取3.00g桃金娘粉末于錐形瓶?jī)?nèi)，以10∶1的液料比分別加入30mL的蒸餾水、0.5%鹽酸-蒸餾水、0.5%鹽酸-75%乙醇、75%乙醇、0.5%鹽酸-75%甲醇、75%甲醇、乙酸乙酯、石油醚。在55℃下振蕩提取2.0h，8000r/min離心 15min，抽濾，全部濾液定容至100mL，觀察色澤差異，初步確定該色素的最佳提取溶劑，并用UV-1800紫外可見分光光度計(jì)在400～700nm的波段內(nèi)掃描各提取液的最大吸收波長(zhǎng)(λmax)，最終確定該色素的最佳提取溶劑。

1.2.4 提取劑最佳pH的確定 用鹽酸將提取溶劑的 pH 分別調(diào)為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，其他操作同

1.2.3 ，在400～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描確定提取溶劑的最佳提取pH，并對(duì)1.2.3得到的最大波長(zhǎng)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，取樣品1.00g進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)并將提取液定容至50mL，以提取時(shí)間(A)、乙醇濃度(B)、液料比(C)、提取溫度(D)為自變量，最大吸收波長(zhǎng)處吸光值為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素五水平的二次回歸方程擬合自變量和色素吸光值之間的函數(shù)關(guān)系，采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化提取工藝。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表

表2 桃金娘色素在不同提取劑中的溶解性和色澤變化

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇及最大波長(zhǎng)的確定

由表2和圖1可見，乙醇和甲醇的酸性溶液更適合于作為桃金娘色素的提取溶劑，這兩種提取劑得到的色素提取液具有明顯的吸收峰，且均在520nm。從安全性角度考慮，選取酸性乙醇為最佳提取劑，最大吸收波長(zhǎng)為520nm。

圖1 不同提取劑中的桃金娘色素掃描吸收光譜

2.2 提取劑pH對(duì)提取效果的影響

由圖2可知，由pH1.0的提取液在520nm處具有明顯的吸收峰，且呈紫紅色，其他pH下的吸收峰均不明顯，顏色較淡，可知極酸性條件對(duì)于桃金娘色素具有明顯的護(hù)色效應(yīng)，為了穩(wěn)定后續(xù)單因素的實(shí)驗(yàn)條件將提取劑pH定為1.0。

圖2 不同pH的75%乙醇提取劑中色素掃描吸收光譜

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由于提取時(shí)間影響色素活性物質(zhì)與提取劑的充分接觸，提取劑濃度影響溶劑極性，進(jìn)而影響色素的溶解情況，液料比影響色素是否能最大程度的溶解出來和提取成本的節(jié)約，溫度影響色素的穩(wěn)定性與提取率，因此選取這4個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，單因素結(jié)果表明:提取時(shí)間為4h、乙醇濃度為50%、液料比為20mL/g、提取溫度為65℃時(shí)色素吸光值最大，提取效果最好。因此選取時(shí)間3～5h，乙醇濃度40%～60%，液料比12～28mL/g，提取溫度55～75℃為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)范圍。

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與方差分析 本實(shí)驗(yàn)利用Design-Expert軟件中的中心組合設(shè)計(jì)(CCD)選項(xiàng)，獲得桃金娘色素提取的四因素五水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果，見表3。

表3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)回歸擬合后，各實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響可通過以下回歸方程表示:

色素提取液吸光值=0.58-0.011A+0.027B+0.032C+5.063×10-3D-7.444×10-3AB-4.344×10-3AC-0.016AD-2.069×10-3BC+0.023BD-0.045CD-0.020A2-0.010B2-0.017C2-0.031D2

由方差分析結(jié)果(表4)可知:F回歸模型=69.47＞F0.01，p＜0.0001，方程達(dá)到極顯著水平，同時(shí) F失擬=3.01＜F0.01，P ＞0.05，模型 R2adj為 0.9706，表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可用該方程對(duì)不同提取條件下的色素提取效果進(jìn)行預(yù)測(cè)。

通過回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表5可知，因素A、B、C對(duì)色素提取效果影響極顯著(p＜0.01)，因素D對(duì)色素提取效果影響顯著(p＜0.05);四個(gè)實(shí)驗(yàn)因素的二次項(xiàng)對(duì)色素提取效果影響均為極顯著(p＜0.01)，交互項(xiàng)中 AB對(duì)提取效果影響顯著(p＜0.05)，AD、BD、CD交互項(xiàng)對(duì)提取效果影響極顯著(p＜0.01)，表明各影響因素與響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。對(duì)回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值進(jìn)行比較，可判斷因子影響的主次性［10］，結(jié)合方差分析得到各實(shí)驗(yàn)因子對(duì)色素提取液吸光度的影響主次順序?yàn)?液料比＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞提取溫度。

依據(jù)方差分析結(jié)果，剔除不顯著項(xiàng)，簡(jiǎn)化后的回歸方程為:

色素吸光值=0.58-0.011A+0.027B+0.032C+5.063×10-3D-7.444×10-3AB-0.016AD+0.023BD-0.045CD-0.020A2-0.010B2-0.017C2-0.031D2

2.4.2 各因素間的交互作用分析 如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度相對(duì)平緩，表明其可以忍受處理?xiàng)l件的變異，而不影響到響應(yīng)值的大小，相反，如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度非常陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件的改變非常敏感［11］。本實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值對(duì)交互項(xiàng)中 AB、AD、BD、CD交互作用較為敏感，即這四個(gè)交互項(xiàng)方差分析結(jié)果顯示顯著或極顯著。

由圖3可知，提取時(shí)間和乙醇濃度的交互作用對(duì)色素提取效果影響顯著(p=0.0198)，時(shí)間小于4h時(shí)，隨著時(shí)間增大色素提取量逐漸增大，當(dāng)時(shí)間大于4h以后，隨著時(shí)間增大色素提取量逐漸下降;在低乙醇濃度(40%～55%)條件下，隨提取劑濃度的增大，色素提取量逐漸增大，當(dāng)濃度超過55%之后，隨提取劑濃度增大，色素提取效果趨于平緩，并有下降趨勢(shì)。

圖3 提取時(shí)間和乙醇濃度的交互作用對(duì)色素提取效果的影響

由圖4可知，提取時(shí)間和提取溫度的交互作用對(duì)色素提取效果影響極顯著(p＜0.0001)，在4.5h之內(nèi)隨時(shí)間增大色素提取量逐漸增大，當(dāng)時(shí)間超過4.5h后隨時(shí)間增大色素提取量明顯降低;在低溫條件下(55～65℃)，隨著溫度的增加色素提取量明顯增大，當(dāng)溫度超過65℃后，隨著溫度的增加色素提取效果明顯下降。

圖4 提取時(shí)間和提取溫度的交互作用對(duì)色素提取效果的影響

由圖5可知，乙醇濃度和提取溫度的交互作用對(duì)色素提取效果影響極顯著(p＜0.0001)，在低溫條件下(55～65℃)，隨著乙醇濃度的增大，色素提取效果緩慢增加，當(dāng)乙醇濃度超過55%之后，隨著濃度的增大，色素提取效果呈明顯降低趨勢(shì)，在較高溫度下(65～75℃)，隨著乙醇濃度逐漸增大，色素提取效果始終呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。乙醇濃度在40%～60%范圍內(nèi)變化時(shí)，隨著溫度的增大，以65℃為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，色素提取量先增大后下降。

表4 色素提取回歸模型方差分析表

表5 色素提取回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

圖5 乙醇濃度和提取溫度的交互作用對(duì)色素提取效果的影響

由圖6可知，液料比例和提取溫度的交互作用對(duì)色素提取效果影響極顯著(p＜0.0001)，在低溫條件下(50～60℃)，隨著液料比例的增大，色素提取效果始終呈增大趨勢(shì)，在較高溫度下(60～75℃)，隨著液料比例的增大，色素提取效果明顯下降;在小液料比(12～16mL/g)條件下，隨著溫度的增大，色素提取效果逐漸增大。在較大液料比(16～28mL/g)條件下，隨著溫度的增大色素提取效果明顯下降。

圖6 液料比和提取溫度的交互作用對(duì)色素提取效果的影響

2.5 最佳提取條件選擇與驗(yàn)證

運(yùn)用Design-Expert處理得到四個(gè)因素的最佳組合為:提取時(shí)間3.56h，乙醇濃度54.55%，液料比22.36，溫度64.78℃，在該條件下色素理論最大提取值為0.6070。為了考察該最佳條件組合的可靠性，在該條件下對(duì)色素最大提取量進(jìn)行驗(yàn)證，考慮到實(shí)際可操作性，提取時(shí)間定為3.6h，乙醇濃度定為55%，液料比定為22mL/g，溫度定為65℃對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)4次實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)際色素吸光值為0.6177，與理論預(yù)測(cè)值較為接近，誤差為0.0176，表明該數(shù)學(xué)模型對(duì)優(yōu)化桃金娘色素提取工藝的可行性較好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用全波長(zhǎng)掃描得到桃金娘色素的最大吸收波長(zhǎng)λmax為520nm，并確定pH為1.0的酸性乙醇為最佳提取試劑，采用響應(yīng)面法得到桃金娘色素最佳提取工藝為:提取時(shí)間3.56h，乙醇濃度54.55%，液料比22.36mL/g，溫度64.78℃。在此條件下的驗(yàn)證值為 0.6177，與理論預(yù)測(cè)值 0.6070較接近，誤差為0.0176。

［1］周立國(guó).食用天然色素及其提取與應(yīng)用［M］.濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社，1993.

［2］黎彧.利用天然資源開發(fā)食用色素［J］.資源開發(fā)與市場(chǎng)，2003(4):245-247.

［3］Hvr W H，Man M.Two new truterpenoids from rhoddmyrtus tuimentosa［J］.Phytochemistry，1976，115:1741-174.

［4］江彩華，方偉章，丁文恩，等.桃金娘保健飲料的開發(fā)研究［J］.林業(yè)實(shí)用技術(shù)，2003(6):10-11.

［5］Surasak L，Supayang P V.Boesenbergia pandurata(Roxb.)Schltr.，Eleuthe rineamericana Merr.and Rhodomyrtus tomentosa(Aiton)Hassk.As antibiol Producing and antiquorum sensing in Streptococcus pyogenes［J］.FEMS Immunology ＆ Medical Microbiology，2008，53(3):429-436.

［6］陳火君，江曉燕.桃金娘開發(fā)應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(2):109-111.

［7］張奇志，廖均元，林丹瓊.桃金娘天然保健飲料開發(fā)研究［J］.飲料工業(yè)，2008，11(20):32-34.

［8］吳文.桃金娘、枸杞、紅棗保健飲料的研制［J］.飲料工業(yè)，2005，8(5):17-19.

［9］段純明，董海洲.膨化玉米黃粉中天然黃色素的制取工藝研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007(3):128-132.

［10］周存山，馬海樂，胡文彬.多斑紫菜多糖提取工藝的優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2006，22(9):192-197.

［11］陳莉，屠康，王海，等.采用響應(yīng)曲面法對(duì)采后紅富士蘋果熱處理?xiàng)l件的優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2006，22(2):159-163.

Optimization of extraction technique of pigment from Rhodomyrtus tomentosa by response surface methodology

ZHANG Shao-min，CHEN Wen-fen，ZHAO Mou-ming*
(College of Light Industry and Food，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

TS202.3

B

1002-0306(2010)08-0190-05

2009-12-24 *通訊聯(lián)系人

張少敏(1987-)，女，碩士研究生，研究方向:食品生物技術(shù)。

國(guó)家863計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2007AA100404);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008A010900003)。