肖 平，周麗珍，李 艷，劉 冬，*

(1.深圳職業(yè)技術學院，廣東深圳518055;2.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004)

降血壓肽制備工藝的研究進展

肖 平1，2，周麗珍1，李 艷1，劉 冬1，*

(1.深圳職業(yè)技術學院，廣東深圳518055;2.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004)

綜述了降血壓肽制備工藝的研究現狀，指出基因工程法結合層析技術是今后降血壓肽制備研究的主要方向。

降血壓肽，制備工藝，酶法，基因工程法

Abstract:The preparation progress of antihypertensive peptides was reviewed.Gene engineering combined with chromatography separation was indicated to be the main research direction for the antihypertensive peptides preparation in the future.

Key words:antihypertensive peptides;preparation technology;enzymic method;genetic engineering method

降血壓肽(antihypertensive peptides，AHP)是一類能夠顯著降低高血壓病人血壓的多肽總稱。它是血管緊張素轉化酶(agiotensin converting enzyme，ACE)的抑制劑，能夠通過抑制人體腎素－血管緊張素系統(tǒng)中血管緊張素II的生成而達到降低血壓的目的，因此降血壓肽又稱血管緊張素轉化酶抑制肽(agiotensin converting enzyme inhibitor peptid，ACEIP)。與目前一線臨床常用的 ACE抑制劑(agiotensin conver－ting enzyme inhibitor，ACEI)類抗高血壓藥物相比，降血壓肽只對高血壓患者起到降壓作用，對血壓正常者無明顯降壓作用，且無任何毒副作用［1－2］，因此，是一種極具開發(fā)潛力的多肽類抗高血壓藥物。許多動物、植物、微生物蛋白及發(fā)酵食品中都含有豐富的降血壓肽。迄今，許多研究者采用酶解法結合不同的分離純化工藝從這些天然蛋白質中得到了一系列具有降壓效果的多肽單體［3－4］，但由于天然蛋白中降血壓肽含量低、分離純化過程復雜等原因導致產品成本過高，至今仍無商業(yè)化產品面市。采用微生物基因工程法大規(guī)模表達降血壓肽克服了天然原料降血壓肽含量有限的缺點，但分離純化工藝仍是當前制約降血壓肽產業(yè)化生產的瓶頸。本文全面綜述和評價了迄今文獻報道的降血壓肽的制備工藝技術，以期為其他研究者和降血壓肽產業(yè)化生產提供一定的參考。

1 從天然蛋白質中制備降血壓肽

天然蛋白中含有大量具有ACE抑制活性的降血壓肽，因此，以天然蛋白為原料，利用蛋白酶水解結合各種分離純化技術制備降血壓肽成為降血壓肽制備研究的主要方法。也有研究人員從一些天然食物和發(fā)酵食品中直接提取ACE抑制肽。

從天然蛋白中制備分離降血壓肽的一般工藝流程是:

圖1 從天然蛋白中制備分離降血壓肽的一般工藝流程

采用酶解法制備降血壓肽技術的關鍵環(huán)節(jié)是含有高活性、高含量降血壓肽的天然蛋白質原料的選用、特異性酶的選擇以及各種分離純化技術的選擇與優(yōu)化。

1.1 原料的選擇

迄今，許多學者分別成功地從酪蛋白、乳清蛋白、乳酸菌提取物、清酒、酒糟、酸奶、蛇毒、明膠、牛皮凝膠、蝦蟹、鰹魚、鰱魚、沙丁魚、金槍魚、玉米、大豆、麥胚、紫菜、花生、無花果、茶葉、大蒜等中通過酶解、發(fā)酵等方法經分離純化得到了大量不同序列的AHP［5－6］。目前，從新的動物、植物及微生物原料中發(fā)現和分離鑒定新的降血壓肽仍然是降血壓肽研究的熱點領域。

含有高活性、高含量降血壓肽單體的蛋白質原料的選用是獲取高活性、高療效AHP產品的前提條件。從目前已報道的具有降血壓肽活性的多肽氨基酸組成來看，雖然各種降血壓肽沒有固定的氨基酸組成和結構，但絕大多數高活性的降血壓肽主要由疏水性氨基酸組成，如大多數降血壓肽的C－末端都具有輔氨酸;C－末端倒數第三個氨基酸為芳香族氨基酸有助于ACE抑制劑與ACE的結合;疏水性氨基酸對于肽正確進入ACE活性中心是必要的［7］。因此，富含此類氨基酸的蛋白質適合作為酶法生產降血壓肽的原料。

表1 國內外學者從天然蛋白中分離出的AHP

1.2 蛋白水解酶的選擇

天然蛋白經過蛋白水解酶的催化可以釋放出許多種具有降血壓活性的多肽。由于一般不知道原料蛋白質的一級結構，并且ACE抑制肽也沒有一個固定的結構，所以酶法生產ACE抑制肽存在一定的盲目性。實際生產中對酶種類和酶解工藝的選擇沒有固定的方法，需要通過不斷的實驗摸索來確定最佳的酶和水解工藝條件，主要參考以下幾個方面來對酶進行篩選。

選擇的酶多為內肽酶，而不是端肽酶，這樣可以避免產生過多的游離氨基酸而影響后續(xù)的多肽分離。酶解時，根據不同的原料及工藝要求選擇不同種類的酶，可以是用單一酶進行酶解，也可以用兩種或多種酶共同進行反應。不同的蛋白酶水解產生的多肽活性不同。吳建平等人的研究表明，多酶法的作用效果與單酶法相比并沒有明顯的優(yōu)勢［8］。降血壓肽活性與其結構有著密切的關系，如C－末端氨基酸為芳香族氨基酸和脯氨酸時與ACE結合能力很強，ACE活性較高;N－末端最具活性的是長鏈或者具有支鏈的疏水性氨基酸，而當N端為Pro時活性降低;可以看出降血壓肽結構與活性的關系對蛋白水解酶系的篩選具有重要的指導意義［9］。另外在選擇酶時最好根據酶水解的特異性進行選擇，如胰凝乳蛋白酶水解由芳香族氨基酸的羧基所形成的肽鍵;胃蛋白酶能迅速水解由芳香族氨基酸的氨基和其他氨基酸形成的肽鍵，也能較緩慢地水解其他一些氨基酸(如Leu)和酸性氨基酸參與形成的肽鍵;堿性蛋白酶也有終端疏水性氨基酸的專一性，主要水解疏水性氨基酸如:Leu、Ile、Val等的終端;嗜熱菌蛋白酶水解由 Val、Leu、Ile、Phe、Typ、Met等疏水性氨基酸的氨基端形成的肽鍵［5］。對于酶的選擇還要考慮來自于原料的影響，如玉米醇溶蛋白的嗜熱菌蛋白酶水解物降血壓活性非常高，這除與該蛋白酶的作用位點有關外，還因為玉米醇溶蛋白有較高含量的Pro及其它疏水性氨基酸［7］。

目前已經應用在降血壓肽生產的蛋白酶主要有堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃胰蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、膠原蛋白酶等［5］。

1.3 分離純化工藝選擇

多肽類分離提取常用的方法包括:超濾、離子交換層析、凝膠過濾層析、HPLC、RP－HPLC、薄層色譜、毛細管電泳等。由于許多ACE抑制肽結構很接近，食物蛋白質酶解成分相當復雜，需要綜合考慮多肽分子量分布、電荷種類和帶電量以及分子極性大小等理化性質，然后再選用不同的分離純化單元操作技術對其進行分離純化，以達到更好的分離效果。大體的分離步驟是先用沉淀離心或活性碳吸附的方法除去較高分子量、未水解的蛋白質，用超濾除去不溶底物、分子量較大蛋白質和肽類以獲得合理的氨基酸和短肽，再根據分子量大小，采用凝膠過濾分離得到目的短肽，如果ACE抑制肽結構相近，則需根據電荷、分子極性差異等性質結合離子交換層析、疏水層析和RP－HPLC等其它分離方法來達到分離目的。

表1列舉了部分國內外學者采用不同的分離純化工藝從天然蛋白中分離出的AHP。

從目前降血壓肽分離純化研究的報道中可以看出，采用單一方法往往難以獲得較好的分離效果，大多屬于初步分離，在進行分離純化時，最好是將分離原理不同的2種或多種手段結合使用，從而獲到更高純度的降血壓肽組分。這也可能成為今后降血壓肽分離純化研究的一個主要方向。

2 基因工程法制備降血壓肽

現在，利用基因工程技術生產藥物、食品原料已越來越多，如利用基因工程法生產抗菌肽、干擾素等肽類藥物已經產業(yè)化，為利用基因工程技術制備降血壓肽提供了借鑒。

利用基因工程法制備分離降血壓肽的一般工藝流程是:

圖2 利用基因工程法制備分離降血壓肽的一般工藝流程

利用基因工程技術制備降血壓肽的關鍵環(huán)節(jié)是降血壓肽基因表達系統(tǒng)的構建和下游分離純化技術的選擇及工藝條件的優(yōu)化。

2.1 基因表達系統(tǒng)的選擇與構建

應用于重組降血壓肽的常用的基因表達系統(tǒng)有大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)等。大腸桿菌表達系統(tǒng)因其具有低廉性、高效性、穩(wěn)定性、操作簡單和可以大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點而被廣泛應用［21］。酵母既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作等特點，同時又具有真核生物蛋白質加工、折疊、翻譯后修飾等的功能，因此，酵母現已成為現代分子生物學研究最重要的工具和模型，是表達外源基因比較理想的宿主［22］。構建降血壓肽基因表達系統(tǒng)的大致流程是:選擇高降血壓活性的多肽單體并設計能在表達系統(tǒng)內高效表達的降血壓肽基因序列，克隆至表達載體并轉接至宿主菌中高效表達。

利用基因工程技術生產小分子肽，困難在于小分子肽產物易被降解和表達量低。目前解決這個問題的主要方法是采用融合蛋白表達、在蛋白酶缺陷宿主菌中表達和增加基因拷貝等技術。融合蛋白表達技術是通過將目的基因引入某個高表達蛋白序列(fusion tag)的3’末端，比如大腸桿菌的一段序列，或者任一可在大腸桿菌中高效表達的基因，它提供良好表達所必需的信號，而表達出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag編碼的片段。目前使用最廣泛的蛋白酶缺陷性宿主菌為E.coli BL21及其衍生菌株，它的優(yōu)點在于缺失Lon和OmpT蛋白酶，可有效防止表達的外源蛋白的降解。增加基因串聯(lián)表達的基本思路是，在小肽基因兩端引進限制性核酸內切酶酶切位點，利用其酶切后產生的粘性末端，經連接酶連接，體外構建其多拷貝的小肽基因［7］。

G.S.Lv等成功構建出降血壓肽基因:FFVAPFPEVFGK(Phe－Phe－Val－Ala－Pro－Phe－Pro－Glu－Val－Phe－Gly－Lys)，克隆至表達載體 pQE16 并轉化E.Coli JM109，IPTG誘導表達，SDS－PAGE電泳檢測，融合蛋白(二氫葉酸還原酶－AHP)表達的量達到 500μg/L［23］。劉冬等選擇 KVLPVP(Lys－Val－Leu－Pro－Val－Pro)為理想降血壓肽序列，利用胰蛋白酶的特異位點－Arg↓和羧肽酶B特異位點－Pro↓Arg將選定的六肽連接成6拷貝的串聯(lián)四十二肽，根據大腸桿菌偏愛密碼子合成重組降血壓肽基因序列，克隆至原核表達載體 pGEX－4T－2，并轉化 E.Coli BL21(DE3)，SDS－PAGE電泳檢測，融合蛋白 GSTAHP(谷胱甘肽S－轉移酶－降血壓肽融合蛋白)占大腸桿菌胞內總蛋白的23%［24］。

目前，也有研究人員不通過融合蛋白表達技術，而直接將降血壓肽基因克隆至表達載體，以串聯(lián)多聚體形式在宿主菌中表達。HASAN.MD等構建出降血壓肽基因PTHIKWGD，并編碼串聯(lián)重復成一T6拷貝的多聚體，克隆至表達質粒 pK2TF－TP，并轉化E.Coli BL21(DE3)，1mmol/L IPTG誘導表達，重組串聯(lián)肽以包含體形式表達，表達量為330mg/L，約占大腸桿菌胞內總蛋白的55%。包含體通過酸水解后裂解成單一肽PTHIKWGD，并通過免疫親和層析和RP－HPLC法可得到完全純化，降血壓肽的含量為105～115mg/L培養(yǎng)基，經過人工胃液或酸水解后生物活性沒有發(fā)生變化，IC50為 2μmol/L［25］。這一新穎的方法克服了傳統(tǒng)的融合蛋白表達技術，水解純化工藝更加簡單，成本少，產量高，擁有相當廣闊的發(fā)展前景。

2.2 分離純化工藝選擇

相比酶解法制備分離降血壓肽水解產物復雜、分離產物不明確、分離純化環(huán)節(jié)多，利用基因工程技術制備分離降血壓肽的目標明確，分離純化工藝更為簡單。通常采用離心技術、超濾技術、大孔樹脂吸附技術等方法對降血壓肽進行粗提取，然后根據被分離目標多肽分子量、電荷大小或分子極性等性質選用離子交換層、凝膠過濾、親和層析、RP－HPLC等分離純化技術對目標物進行進一步純化。當前，如何實現降血壓肽的產業(yè)化生產是所有研究者面臨的最大難題，這直接影響到降血壓肽推廣應用的前景，建立一套適宜的分離提取技術工藝是將降血壓肽推向商業(yè)化生產的必要條件，分離提取的效率將直接影響到ACE抑制肽的應用前景。

劉冬等在對利用基因工程技術生產降血壓肽研究中，采用親和層析法對GST－AHP進行分離，GSTAHP吸附量達3.86mg/mL，回收率達到96.5%，并通過RP－HPLC法對降血壓肽進行純化，可實現降血壓肽的完全分離，重組降血壓肽 KVLPVP的 IC50為4.6μmol/L，對ACE為競爭性抑制，動物實驗表明，給藥劑量為300μg/kg(體重)時，AHP對高血壓大鼠具有顯著降壓效果，而對血壓正常大鼠無顯著的降血壓作用［24］。盧真保在劉冬等人已構建好的降血壓肽基因表達系統(tǒng)的基礎上，采用HPD－100B型大孔吸附樹脂對降血壓肽 VLPVPR(Val－Leu－Pro－Val－Pro－Arg)進行分離，上樣量180mL，上樣流速3mL/min，上樣結束后用水和8%乙醇各洗滌60mL，流速均為1mL/min，而后改用60%乙醇以0.25mL/min洗脫45mL，此工藝下VLPVPR的回收率為92.7%，純度為28.8%，比純化前提高了65倍，體外檢測對ACE具有較強的抑制活性，其 IC50為 4.1μmol/L［26］。

3 總結與展望

目前，降血壓肽主要采用蛋白酶酶解法從天然蛋白中分離純化獲得，該方法存在天然原料降血壓肽含量低、專一性蛋白酶篩選繁瑣、水解產物復雜、分離純化環(huán)節(jié)多、產量低、產品成本高等問題，這些問題制約了降血壓肽的產業(yè)化。利用基因工程技術生產降血壓肽不受原料來源限制、生產周期短、下游分離純化工藝簡單，是克服上述困難進行大規(guī)模生產的重要途徑，具有廣闊的應用前景，這也可能將成為今后降血壓肽研究發(fā)展的一個趨勢。

大量研究表明，多種層析技術是進一步高度純化降血壓肽的有效工具，采用多種分離方法分步驟結合使用，可以實現降血壓肽的高度純化。基因工程法相比酶解法擁有更多的優(yōu)越性，基因工程技術結合層析技術制備分離降血壓肽可能將成為今后研究發(fā)展的主要方向之一。同時，采用串聯(lián)多聚體表達技術代替融合蛋白表達技術構建基因表達系統(tǒng)、發(fā)掘采用更多新型高科技層析填料應用于降血壓肽的分離純化等研究將更加廣泛地推動降血壓肽的發(fā)展。

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Progress of preparation technology on antihypertensive peptides

XIAO Ping1，2，ZHOU Li－zhen1，LI Yan1，LIU Dong1，*
(1.Shenzhen Vocational and Technical College，Shenzhen518055，China;2.College of Light Industry and Food Engineering of Guangxi University，Nanning 530004，China)

TS201.2+1

A

1002－0306(2010)08－0417－05

2009－07－24 *通訊聯(lián)系人

肖平(1985－)，男，碩士研究生，研究方向:食品生物技術。

廣東省科技廳科技攻關項目(2206K045BA)。