馬永全,于新,黃雪蓮,楊敏

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州,510225)

南藥五味子提取物的抗菌及抗氧化作用＊

馬永全,于新,黃雪蓮,楊敏

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州,510225)

應(yīng)用瓊脂平板擴散法、DPPH·法、結(jié)晶紫法、鄰苯三酚自氧化法,測定五味子提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌活性及清除 1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)、羥自由基(·OH)、超氧陰離子(·)的能力。結(jié)果表明,五味子提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、乙型副傷寒沙門氏菌 3種食品常見致病菌均具有強的抑菌作用,抑菌圈直徑均在 20 mm以上。其中,五味子乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、沙門氏菌的抑菌圈和MIC及對 DPPH·、·OH、·清除活性 EC50分別為 34.8 mm,28.6 mm,23.2 mm,0.1250 g/mL,0.0313g/mL,0.1250 g/mL,0.69 mg/mL,0.78 mg/mL,0.57 mg/mL;蒸餾水提取物的抑菌圈和MIC清除率分別為 25.4 mm,23.0 mm,23.4 mm,0.1250 g/mL,0.0625g/mL,0.1250 g/mL,0.72 mg/mL,0.63 mg/mL,0.61 mg/mL。說明五味子提取物具有明顯的抗菌和抗氧化作用。

南藥五味子,提取物,抗菌作用,抗氧化作用

南藥五味子(Kadsura longipedunculata),又稱華中五味子,屬五味子科(Schisandraceae)五味子屬(Schisandra)植物,是我國衛(wèi)生部 2002年公布的可用于保健食品的中草藥之一。具有益氣 、斂肺、生津、止渴、止瀉、斂汗、壯陽、補腎等功能,是產(chǎn)自我國的名貴中藥材[1-2]。五味子及其部分親緣種普遍含有木脂素,且不同品種的含量和成分有較大差異,一般含有揮發(fā)油、有機酸及脂肪油,此外還含有五味子甲素、乙素、乙醇及甲、乙、丙、丁、戊酯等成分[3]。動物和臨床實踐證實,五味子對病毒性肝炎或化學(xué)中毒性肝損傷有降低轉(zhuǎn)氨酶和改善癥狀的作用,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有興奮作用,能改善條件反射的形成,提高大腦皮層細胞的機能[4]。據(jù)報道,五味子提取物對大鼠腦、肝、腎微粒體的脂質(zhì)過氧化有顯著的抑制能力,可維持斷奶仔豬血液正常生化指標[5-6]。但有關(guān)五味子提取物抑菌活性的報道甚少。本試驗采用 2種不同溶劑的提取物,研究了五味子提取物的抗菌和抗氧化作用,旨在為開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 材料與儀器

五味子果實,購于廣東陽西縣。

電子天平(Sartorial公司);MJ-176NR型多功能粉碎機(松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社);DHG-9140A型電熱恒溫干燥箱(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司);PHS-25型酸度計(上海偉業(yè)儀器廠);UV-1700型紫外可見分光光度計(島津分析儀器廠);HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市金城國勝試驗儀器廠);TGL-16C型臺式離心機(上海安寧科學(xué)儀器廠);R201D-II型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(無錫星海王生化設(shè)備有限公司)。

1.1.2 菌種

大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院微生物實驗室;乙型副傷寒沙門氏菌(Salm onella paratyphiB,CMCC50094),廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.3 試劑

1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)、鄰苯三酚,為美國 Sigma公司產(chǎn)品。結(jié)晶紫、FeSO4、30%H2O2、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、KH2PO4、K2HPO4、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 五味子 70%乙醇和水提取物的制備

五味子經(jīng) 60℃干燥后粉碎,過 60目篩,取五味子粉 10 g,用 70%乙醇和蒸餾水進行 80℃水浴,料液比為 1∶10,浸提6h。將浸出液根據(jù)不同需要濃縮至不同體積,定容,4℃貯存?zhèn)溆?抗菌試驗前需經(jīng)121℃,30 min滅菌 )。

1.2.2 菌液的制備

將各試驗菌種活化后,用生理鹽水配成菌懸液,經(jīng)比濁法判定菌量,稀釋到 109CFU/mL。

1.2.3 抑菌圈的測定

待培養(yǎng)基冷卻到 55℃左右,接入含菌量為 109CFU/mL的指示菌的菌懸液,接種量為 10%。滅菌后將 3個牛津杯放在培養(yǎng)皿上。每種菌倒 5個平板,3個作為平行組,2個作為對照組。培養(yǎng)基完全凝固后,取出牛津杯。用移液槍往平行組培養(yǎng)皿的各小孔內(nèi)加入 0.06 mL的五味子提取物,對照組培養(yǎng)皿小孔內(nèi)加入 0.06 mL無菌水作為對照。把各平板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后,測量抑菌圈直徑。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)的測定

分別取滅菌試管 8支,將提取物濃縮液1mL以滅菌生理鹽水倍比稀釋(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280),另用無菌水加入 9 mL瓊脂培養(yǎng)基做無提取液的對照,倒 10 mL瓊脂培養(yǎng)基作為無菌水的對照。每種菌倒 7個平板,3個作為提取液的平行組,2個作為無提取液的對照組,2個作為無菌水的對照組。待完全凝固后加 0.1 mL菌懸液涂布于平板上(無菌水對照組則加 0.1 mL無菌涂布),在 37℃下培養(yǎng) 24 h,觀察菌落生長情況,以不長菌的五味子提取物最低濃度為 3種食品常見致病菌的最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.5 提取物對 DPPH·清除率的測定

參照Vattem等[7]的方法。用蒸餾水和 70%乙醇分別配制濃度為 0.2 mg/mL,0.4 mg/mL,0.6 mg/mL,0.8 mg/mL,1.0 mg/mL和 1.2 mg/mL提取物溶液,精確吸取不同濃度的提取物溶液 2.0 mL放入試管中,加入 2.0×10-4mol/L DPPH·溶液(無水乙醇配制)2.0 mL,搖勻后于室溫下放置 30 min,測定其在 517 nm處的吸光度值(AS);以水或 70%乙醇代替樣品為空白對照(A0);以 2.0 mL不同濃度的提取物溶液與 2.0 mL水或 70%乙醇混合液為樣品對照(AX),以消除樣品本身顏色的影響;以水或 70%乙醇校正儀器 0點,重復(fù)測定 3次。清除率 R計算:

1.2.6 提取物對羥自由基(·OH)的清除率的測定

采用結(jié)晶紫分光光度法[8],用蒸餾水和 70%乙醇分別配制濃度為 0.2 mg/mL,0.4 mg/mL,0.6 mg/mL,0.8 mg/mL,1.0 mg/mL和 1.2 mg/mL的提取物溶液。具體試驗步驟為在一系列 50 mL具塞比色管中分別加入 0.4 mmol/L結(jié)晶紫溶液 1.5 mL,1.0mmol/L FeSO4溶液 2.0 mL,2.0 mmol/L H2O2溶液 1.0 mL。調(diào)至 pH 4.0,稀釋到 50 mL并搖勻,放置30 min后,測 580 nm處的吸光度 A,同時測定不加H2O2時 580 nm處的吸光度 A0。則羥自由基的產(chǎn)生量可以用ΔA=A-A0表示。樣品液對羥自由基清除率的測定:在上述反應(yīng)體系中加 H2O2之前,加入2mL蒸餾水或 70%乙醇抽提的不同濃度的五味子提取物溶液,測定其吸光度 AS,樣品組對·OH的清除率(R)計算:

1.2.7 提取物對超氧陰離子(·)清除率的測定

采用鄰苯三酚自氧化法[9-10]。用蒸餾水和 70%乙醇分別配制濃度為 0.2 mg/mL,0.4 mg/mL,0.6 mg/mL,0.8 mg/mL,1.0 mg/mL和 1.2 mg/mL的提取物溶液。具體操作為:每支試管加入 3.0 mL Tris-HCl緩沖液(pH8.2),0.2 mL五味子提取液,(37±0.5)℃水浴平衡 10 min后,加入 7 mmol/L的鄰苯三酚溶液 0.3 mL,準確反應(yīng) 4.0 min,加入 12 mol/LHCl0.8 mL終止反應(yīng),在 320nm處測吸光度,計算清除率(R):

式中:A0,空白液的吸光度,以蒸餾水或 70%乙醇代替樣品液的吸光度;As,樣品組的吸光度;A1,五味子提取物本身的吸光度,以蒸餾水或 70%乙醇代替反應(yīng)試劑的吸光度。

2 結(jié)果分析

2.1 抑菌圈測定結(jié)果

五味子乙醇、水提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、乙型副傷寒沙門氏菌 3種食品常見致病菌均具有強抑菌作用,抑菌圈直徑均在 20 mm以上,醇提物的抑菌效果強于水提物的抑菌作用。其中醇、水提物對大腸桿菌的抑菌圈分別為 34.8 mm、25.4 mm,對乙型副傷寒沙門氏菌的抑菌圈達 23.2 mm、23.4 mm,對金黃色葡球菌的抑菌圈達 28.6 mm、23.0 mm。

2.2 最低抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果

五味子乙醇、水提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、乙型副傷寒沙門氏菌 3種食品常見致病菌的MIC均很低,當濃度稀釋到 0.1250 g/mL時,仍能對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門氏菌達到100%的抑菌效果。濃度為 0.0625g/mL時,醇提取對金黃色葡萄球菌仍可抑制,水提取對大腸桿菌也可抑制,對其它菌則無抑制作用。最終結(jié)果表明,水提物對大腸桿菌的 MIC為 0.0625g/mL,金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門氏菌的MIC為0.1250 g/mL;醇提物對金黃色葡球菌的MIC可低至 0.0313g/mL,對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌的 MIC為0.1250 g/mL。

2.3 五味子提取物對DPPH·的清除效果

五味子水和乙醇的提取物對 DPPH·具有較好的清除作用,結(jié)果如圖 1所示。

圖1表明,五味子提取物對 DPPH·具有較高的清除率,且清除率隨提取物濃度的增加而增強。當其濃度為 1.2 mg/mL時,水提取物和醇提取物的清除率分別為 88.16%和 93.83%。在試驗濃度范圍內(nèi),乙醇提取物對 DPPH·的清除率均高于水提取物。說明對DPPH·的清除物質(zhì)在水和醇溶液下均存在。以體系中DPPH·的吸光值減少 50%時抗氧化劑的濃度為準,即半數(shù)抑制濃度(EC50)。南五味子水、醇提取物清除 DPPH·的 EC50分別是 0.72 mg/mL和0.69 mg/mL。

2.4 五味子提取物對·OH的清除效果

五味子水和乙醇的提取物對·OH的均有抑制作用,水提物的清除作用強于醇提物。結(jié)果見圖2。

圖2 五味子提取物對·OH的清除作用

由圖2可知,在 0.2～0.6 mg/mL,水提物的清除率從 23.66%增加到 44.68%,增幅達 19%。在整個試驗濃度范圍內(nèi),水提取物對·OH的清除率均高于醇提取物。水提取物和醇提取物的清除率均隨提取物濃度的增加而增強。但醇提物清除率隨濃度增幅變化不大,可能因為清除·OH自由基的抗氧化物質(zhì)水溶性的較多,而醇溶性的較少。當濃度為 1.2 mg/mL時,水和乙醇提取物的清除率分別為63.17%、32.26%。以體系中·OH的吸光值減少50%時抗氧化劑的濃度為準,即半數(shù)抑制濃度(EC50)。南五味子水、醇提取物清除·OH的 EC50分別是 0.63 mg/mL、0.78 mg/mL。

2.5 五味子提取物對·的清除效果

圖3 五味子提取物對·的清除作用

3 結(jié)論

五味子提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、乙型副傷寒沙門氏菌 3種食品常見致病菌均具有強的抑菌作用,抑菌圈直徑均在 20 mm以上。五味子乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、沙門氏菌的抑菌圈和MIC分別為 34.8 mm,28.6 mm,23.2 mm,0.1250 g/mL,0.0313 g/mL,0.1250 g/mL,對 DPPH·、·OH、·清除活性分別為 93.83%,32.26%,18.22%;蒸餾水提取物對大腸桿菌、金黃色葡球菌、沙門氏菌的抑菌圈和 MIC分別為 25.4 mm,23.0 mm,3.4 mm,0.1250 g/mL,0.0625g/mL,0.1250 g/mL,對 DPPH ·、·OH、·清除率分別為86.16%,63.17%,3.37%。

4 討論

(1)南藥五味子提取物對 G+(金黃色葡萄球菌)、G-(大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌)細菌均有較強的抑制作用,并且在提取物較低濃度時具有較強的抑菌作用?？梢?南藥五味子在食品防腐和水果保鮮等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

(3)五味子提取物對 DPPH·有較高的清除能力,醇提物明顯強于水提取。而對·OH的清除作用,水提物卻強于醇提取。說明清除自由基的抗氧化物質(zhì)既溶于水也溶于醇,但對具體的自由基,其抗氧化物質(zhì)卻有略有不同。初步推斷,對不同自由基具有清除作用的活性物質(zhì)可能為不同成分,或是多種成分綜合作用的結(jié)果,具體抗氧化成分可能是五味子酮、五味子乙素、五味子二醇等。一般認為,抗氧化劑的作用機理主要包括 3個方面:1是對自由基的直接清除作用。2是阻斷自由基的反應(yīng)鏈;3是提高體內(nèi)抗氧化酶活力和抗氧化物質(zhì)含量,如谷胱甘肽等[10]。有研究表明,五味子酚對自由基有直接的清除作用[10]。但五味子中其它抗氧化物質(zhì)抗氧化作用的機理仍在研究中。

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ABSTRACTTo study the effectsofAntibacterial and anti-oxidation of Extracts fromKadsura longipedunculata.The inhibition effect of the extracts fromK.longipedunculataagainstE.coli,S.aureus,S.paratyphiand its scavenging abilities to 1,1-2-phenyl-2-bitter phenylhydrazine radical(DPPH·),hydroxyl radical(·OH),superoxide anion(·)were respectively deter mined via agar plate diffusion method,DPPH·method and pyrogallol auto-oxidation method.The extracts fromK.longipedunculata,with its inhibition zone diameters larger than 20mm,have strong inhibition effect to three kinds of food pathogenic bacteria:E.coli,S.aureusandS.paratyphi.Inhibition zone diameters of inhibition andMI C of ethanol extract againstE.coli,S.aureus,S.paratyphiwere 34.8mm,28.6mm,23.2mm,0.1250g/mL,0.0313 g/mL,0.1250 g/mL respectively,and scavenging abilities to 1,1-2-phenyl-2-bitter phenylhydrazine radical(DPPH·),hydroxyl radical(·OH),superoxide anion(·)were 0.69mg/mL,0.78mg/mL,0.57mg/mL.Distilledwater extract ofK.longipedunculataandMI C againstE.coli,S.aureus,S.paratyphiwere 25.4mm,23.0mm,23.4mm,0.1250 g/mL,0.0625g/mL,0.1250 g/mL respectively and scavenging abilitiesof 1,1-2-phenyl-2-bitterphenylhydrazine radical(DPPH ·),hydroxyl radical(·OH),superoxide anion(·)were 0.72mg/mL,0.63mg/mL,0.61mg/mL.K.longipedunculataextract has strong anti-oxidation and inhibition effect to bacteria.

Key wordsKadsura longipedunculata,extract,antibacterial,antioxidation

Study on Ant im icrobial and Anti-oxidation Activities of Extracts fromKadsura longipedunculata

Ma Yong-quan,Yu Xin,Huang Xue-lian,YangMin
(College of Light Industry and Food Science,ZhongkaiUniversity ofAgriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China)

碩士研究生(于新教授為通訊作者)。

＊廣東省科技計劃項目(2005B20401002)

2010-01-27,改回日期:2010-04-02