劉彩平,崔堂兵

(華南理工大學生物科學與工程學院,廣東廣州,510006)

產(chǎn)纖溶酶微生物的篩選鑒定及生長模型的建立＊

劉彩平,崔堂兵

(華南理工大學生物科學與工程學院,廣東廣州,510006)

使用酪蛋白平板初篩、搖瓶復篩的方法,從9種豆豉中分離到纖溶酶產(chǎn)生菌59株,其中DC-YJ11菌株的酶活較高。通過對其形態(tài)特征、生理生化特征結(jié)合16S rDNA序列分析,鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。并對其構建了系統(tǒng)發(fā)育樹和基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡的生長模型BP-YJ11。

枯草芽孢桿菌,纖溶酶,鑒定,BP神經(jīng)網(wǎng)絡

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(back propagation neural network)是人工神經(jīng)網(wǎng)絡(artificial neural network,ANN)的一種,具有很強的非線性映射能力,故可以反映十分復雜的非線性關系,在發(fā)酵工業(yè)中被廣泛應用,如培養(yǎng)基的優(yōu)化[1]、發(fā)酵建模過程和控制優(yōu)化[2],以及發(fā)酵分批補料控制[3]等,已成為目前研究的熱點之一[4]。

豆豉纖溶酶是一種具有良好溶血栓作用的絲氨酸蛋白酶,與納豆激酶具有類似的生化性質(zhì)和生理學功能[5],與目前臨床使用的纖溶酶原活化因子類(plasminogen activators)溶栓劑如尿激酶、鏈激酶、組織型纖溶酶原激活物(tPA)等相比,具有纖溶活性,分子量小,可通過消化道直接吸收,半衰期長[6],不溶解血細胞,安全無毒[7]等優(yōu)點,是治療血栓病最有效的藥物之一[8]。國內(nèi)外已有關于篩選出產(chǎn)豆豉纖溶酶的枯草芽胞桿菌的報道,對此類菌的研究主要集中于分子水平改良[9]、發(fā)酵條件優(yōu)化[10]和酶的分離純化[11]方面,而此類菌生長模型的詳細研究未見報道。

本文采用酪蛋白平板初篩-搖瓶復篩的策略,從豆豉中篩選豆豉纖溶酶產(chǎn)生菌并對菌株進行菌種鑒定,建立了基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡的生長模型和產(chǎn)酶動力學模型。

1 材料與儀器

1.1 篩選材料

生產(chǎn)于廣東、四川、北京、重慶4地的9種豆豉。

1.2 試劑與儀器

牛纖維蛋白原,Sigma公司;凝血酶,中國藥品生物制品檢定所;標準尿激酶,天普制藥廠;W izard Genomic DNA Purification Kit promega公司;普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒,天根公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。BPG-9240A紫外可見分光光度計,尤尼科(上海)儀器有限公司;SARTORIUS AG標準型pH計,SARTARIUS公司;SHP-450D型生化培養(yǎng)箱,上海森信實驗儀器有限公司;SKYB211B雙層特大容量全溫恒溫培養(yǎng)搖床,廣州科橋?qū)嶒灱夹g設備有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(NA):蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl5g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH7.2。

種子培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl5g,蒸餾水1000 mL,pH7.4。

初篩培養(yǎng)基:麥芽糖15 g,酪蛋白10 g,瓊脂20 g,NaCl 15 g,蒸餾水1000 mL,調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基:麥芽糖15 g,大豆蛋白胨20 g,牛肉浸膏1.5 g,KH2PO41 g,K2HPO42.5 g,MgSO4·7H2O 2.5 g,蒸餾水1000 mL,調(diào)節(jié)pH值至7.0。

2 試驗方法

2.1 高產(chǎn)纖溶酶的菌株篩選

2.1.1 初篩

取適量豆豉(6～8粒),加入到盛有滅菌的玻璃珠和95 mL生理鹽水的錐形瓶中,振蕩20 min,選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度涂布于初篩培養(yǎng)基上,平板數(shù)不少于10個,倒置37℃培養(yǎng),18 h后取出。

2.1.2 復篩

參照齊海萍[12]的方法,略有改進。挑取篩選平板上透明圈大的菌株作為復篩菌株。接種于NA培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)12～16 h,保存于斜面。將上述菌株對應接于種子液,12 h后以2%接種量接入發(fā)酵液(50/250 mL三角瓶)中。37℃,往復式搖床180 r/min培養(yǎng)72 h后,將發(fā)酵液離心,取上清液,稀釋不同倍數(shù),測定其纖溶酶酶活,挑取高產(chǎn)菌株。

2.1.3 纖溶酶酶活的測定方法

根據(jù)Astrup等[13]的方法稍加修改。8.1 mL 1%的瓊脂糖于55℃時加入8.1 mL 0.3%的纖維蛋白原溶液及0.65 mL凝血酶(1BP/mL),混勻倒入平板中,靜置冷卻。在平板上用直徑3 mm的打孔器打孔,每孔點樣10μL樣品,于37℃保溫18 h,測定水解圈的大小,計算其面積,以尿激酶作標準曲線。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)觀察及生理生化特性測定

菌株的形態(tài)特征:在NA培養(yǎng)基上30℃、培養(yǎng)48 h,革蘭氏染色觀察細菌形態(tài)。

生理生化特征:參照東秀珠等[14]的方法對DCYJ11菌株進行生理生化特征鑒定。

2.2.216S rDNA序列測定與比對

利用W izard GenomicDNA Purification Kit提取細菌基因組DNA,以芽孢桿菌16SrDNA保守序列設計特異性引物P16 S L:5′-GA GA G T T TGA T C C T G G C T C A G-3′、P16 S R:5′-G C CCCCGTCAATTCCTTTGAG-3′,進行16S r DNA的PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)分離純化后,送至上海博尚生物技術有限公司測序,然后將所測得16S rDNA序列與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進行比對。

2.3 建立基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡的菌株的生長模型

2.3.1 生物量測定方法

采用比濁法,以發(fā)酵液在660 nm處,測定細胞懸浮液的吸光度OD值,以未接種的培養(yǎng)基等量稀釋作對照。

2.3.2 pH測定方法

用pH計測定。

2.3.3 還原糖測定方法

利用DNS法測定方法。

2.3.4 纖溶酶酶活的測定方法

參照2.1.3方法。

2.3.5 生長曲線的測定

按照2.3.1～2.3.4的方法,每2～10h取1次樣。

2.3.6 BP神經(jīng)網(wǎng)絡編程

使用matlab 2006中文版實現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡工具。具體設計:采用3層神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構,輸入層、輸出層各一個神經(jīng)元。訓練函數(shù)是LM,網(wǎng)絡訓練以均方誤差作為目標誤差,訓練次數(shù)為epoch=500次[15]。以取樣時間和取樣時還原糖含量構成的矩陣為輸入,菌體生物量(OD660)和酶活的1/10(E/10)組成的數(shù)組為輸出建立生長模型。使用20組實驗數(shù)據(jù)訓練神經(jīng)網(wǎng)絡BP-YJ11,同時使用5組非訓練樣本的實驗數(shù)據(jù),驗證網(wǎng)絡的合理性。

3 結(jié)果與分析

3.1 纖溶酶產(chǎn)生菌株的篩選

經(jīng)初篩和復篩,共獲得產(chǎn)纖溶酶的59株菌,其中DC-YJ11的酶活為89.67U/mL(發(fā)酵液),酶活力最高。

3.2 菌株鑒定

3.2.1 DC-YJ11菌株的形態(tài)特征

DC-YJ11革蘭氏染色陽性,細胞形態(tài)呈短桿狀,芽胞中生或偏端生,橢圓或柱形,菌體多成對或鏈狀。

3.2.2 菌落的形態(tài)特征

在NA培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)48 h。單菌落為圓形或近圓形,直徑為4～5 mm,淺黃色,不透明,菌落表面略粗糙,無光澤,邊緣稍不整齊。

3.2.3 生理生化特征

DC-YJ11的生理生化特征實驗結(jié)果見表1。

表1 DC-YJ11菌株生理生化特征

綜合以上DC-YJ11的形態(tài)特征和生理生化特征,參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》,DC-YJ11與枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)非常相近。

3.2.4 DC-YJ1116S rDNA序列分析

測出的DC-YJ11菌株的16S rDNA序列全長為1579 bp,將測得的序列與數(shù)據(jù)庫中已注冊的16S rDNA序列用BLAST程序進行比較分析,在前100個比對結(jié)果中相似性都在99%以上,其中絕大多數(shù)為枯草芽孢桿菌。將Genbank中與DC-YJ11菌株相似性較高的8個菌株,以蠟樣芽胞桿菌為外群,構建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果如圖1所示。

形態(tài)特征、生理生化特征結(jié)合16S rDNA序列比對結(jié)果,鑒定DC-YJ11菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

3.3 基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡的菌株的生長模型的建立

3.3.1 DC-YJ11的生長曲線

DC-YJ11生物量、產(chǎn)物以及培養(yǎng)基pH和還原糖的變化趨勢如圖2所示,細菌在接種到發(fā)酵培養(yǎng)基以后,幾乎沒有延滯期,細菌迅速生長,0～16 h為對數(shù)生長期,此后細胞進入生長穩(wěn)定期。發(fā)酵后期,生物量值略有下降;并且纖溶酶活曲線和還原糖的曲線有明顯的相關關系。

3.3.2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡BP-YJ11的訓練結(jié)果

使用訓練樣本(見表2),對神經(jīng)網(wǎng)絡BP-YJ11進行訓練,仿真后模型的擬和值見表2,圖3為均方誤差曲線。由圖3可知,神經(jīng)網(wǎng)絡BP-YJ11在訓練約100次后,均方誤差達到1.096×10-2。

表2 訓練樣本

圖3 均方誤差曲線

3.3.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡的驗證及模型可信度檢驗

將驗證點輸入訓練好的神經(jīng)網(wǎng)絡BP-YJ11,仿真,通過實測值與模型擬和值對比分析BP-YJ11的準確性,結(jié)果見表3。實驗值與擬和值相比較,均方誤差0.336,相對誤差在5.90%以內(nèi),優(yōu)于賈翠英等6.25%的結(jié)果[16]。進一步利用零點平均偏差(zero mean deviation)分析[17]檢驗模型的可信度。每個變量平均偏差計算如下:

式中,n是實驗數(shù)據(jù)點的個數(shù),Δij是實驗值與模型計算值的差值。

每個變量的方差Sj計算如下:

式中m為變量個數(shù),定義統(tǒng)計量λ為:

λ服從Fm,n-m分布,在本文中,λ服從F2,3分布,經(jīng)計算λ的值為29.688,小于查表得到30.82(置信度99%),這說明,本文所建立的模型具有一定的可信度,所建立的模型的擬合度是可行的[18],能夠滿足試驗要求,可以用該網(wǎng)絡模型進行枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶產(chǎn)酶進程曲線和菌體生長曲線的繪制。

表3 驗證樣本及檢驗

4 小結(jié)與討論

近年來不斷有相關文獻報道從豆豉中分離到具有纖溶活性的菌株,一般都是采用直接點纖維蛋白平板法來進行菌株的篩選。本實驗利用酪蛋白平板作為初篩從中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品豆豉中篩選到1株迅速產(chǎn)纖溶酶的菌株DC-YJ11,經(jīng)生理生化試驗及16S rDNA分析,鑒定為枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis),證明了使用酪蛋白平板法篩選產(chǎn)豆豉纖溶酶微生物的可行性,為今后篩選產(chǎn)纖溶酶微生物節(jié)約成本;同時對該菌建立了基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡的高仿真生長模型,為通過人工控制發(fā)酵條件來快速獲得大量的纖溶酶提供了參考,為這類溶栓藥物早日在臨床上大量推廣奠定了基礎。

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ABSTRACTIn this research,fifty-nine strains producing fibrinolytic enzyme were successfully isolated from nine kinds ofDouchi by using casein in plate at first and secondly by both fibrin plates and plas ma plates,and the oneDCYJ11 was the highest fibrinolytic enzyme producing strain.Itwas identified asBacillus subtilisbymorphological,biochemical,physiological characters analysis,and 16S rDNA sequence analysis.This study also constructed a phylogenetic tree and established its growth model based on BP NeuralNetwork.

Key wordsBacillus subtilis,fibrinolytic enzyme,identification,BP NeuralNetwork

Isolation and Identification of the Fibrinolytic Enzyme Producing Stra in and Its Growth Model

Liu Cai-ping,Cui Tang-bing
(College of Biology Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China)

碩士研究生(崔堂兵副教授為通訊作者)。

＊國家自然科學基金項目(30970044)

2010-02-10,改回日期:2010-03-30