謝正軍，劉 艷，沈 晶，池美玲，金征宇

(1. 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

雞骨渣水解用酶的篩選

謝正軍1,2，劉 艷2，沈 晶2，池美玲2，金征宇1,2

(1. 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

以雞骨架高壓蒸煮后的雞骨渣為原料，研究不同蛋白酶對(duì)其酶解效果及酶解產(chǎn)物氨基酸的組成。結(jié)果表明：風(fēng)味蛋白酶具有較強(qiáng)的水解能力，水解度(DH)達(dá)到23.15%；其酶解液澄清度高并具有較強(qiáng)的雞鮮味；其酶解產(chǎn)物中7種必需氨基酸含量為68.90%，谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和精氨酸等風(fēng)味氨基酸分別占氨基酸總量的5.09%、1.40%、2.59%和10.45%。

雞骨渣；酶解；水解度；氨基酸分析

Abstract ：Four proteases, i.e, flavourzyme, neurase, alcalase and papain, were individually used to hydrolyze the residue left after high pressure cooking of chicken bone. The time courses of degree of hydrolysis (DH) of the residue by the proteases were plotted and the sensory characteristics and amino acid composition of the hydrolysates were analyzed. Flavourzyme had better hydrolysis effectiveness than other 3 proteases. The maximum DH of the residue by flavourzyme was measured to be 23.15%.The hydrolysate derived from flavourzyme hydrolysis was good in clarity and had strong chicken flavor. A total of 7 essential amino acids were detected in the hyrolysate, representing 68.90% of the total amino acids. The amino acids responsible for the chicken flavor of the hydrolysate were Glu, Gly, Asp and Arg, respresenting 5.09%, 1.40%, 2.59% and 10.45% of the total amino acids, respectively.

Key words：chicken-bone；hydrolysis；degree of hydrolysis；amino acids analysis

近年來(lái)，我國(guó)的雞肉產(chǎn)量一直穩(wěn)居世界前列。伴隨雞肉生產(chǎn)和加工的發(fā)展，約占雞總質(zhì)量25%的雞骨產(chǎn)量也相當(dāng)可觀[1]。但由于傳統(tǒng)觀念認(rèn)為骨頭的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不如肉，所以大量的雞骨頭被白白浪費(fèi)或加工成附加值很低的產(chǎn)品，因而嚴(yán)重阻礙了骨資源的開(kāi)發(fā)和利用。事實(shí)上骨頭中含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)和VA、VB1、VB2、VB12，還有大腦不可缺少的磷脂質(zhì)、磷蛋白，氨基酸組成合理，蛋白生物價(jià)高[2]，但直接在食品中使用雞骨不僅利用效率低，且不方便操作。近年來(lái)從新鮮動(dòng)物原料中提取的動(dòng)物水解蛋白(HAP)，不但具有良好的風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)豐富，還能體現(xiàn)動(dòng)物的原味特色[3-4]，是一種品質(zhì)極佳的天然調(diào)味料，目前已廣泛地應(yīng)用于方便食品、速凍食品和膨化食品等。動(dòng)物水解蛋白的方法較多，其中酶法是優(yōu)化利用骨蛋白的較好途徑，它可將一般加工溫度和短時(shí)間加熱難以利用的骨膠原蛋白進(jìn)行水解，提高原料利用率，且反應(yīng)條件溫和、周期短、工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，主要以低分子質(zhì)量的短肽和游離氨基酸為主，易于人體消化和吸收[5-6]。

本研究以高壓蒸煮后的雞骨渣為原料，以酶解液的風(fēng)味、水解度等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選用多種蛋白酶進(jìn)行水解和比較，以期為雞骨架的全面合理利用探索更好的技術(shù)途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞骨架 市購(gòu)。

風(fēng)味蛋白酶(酶比活力3萬(wàn)U/g)、木瓜蛋白酶(酶比活力20萬(wàn)U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司；中性蛋白酶(酶比活力73500U/g)、堿性蛋白酶(酶比活力28100U/g)丹麥Novo公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100 Series氨基酸自動(dòng)分析儀 安捷倫科技有限公司；RE52-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海滬西分析儀器廠有限公司；LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高壓蒸煮雞骨架得雞骨渣工藝流程

1.3.2 雞骨渣酶解工藝流程

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

水分含量的測(cè)定：按照GB/T 5009.3—85《食品中水分的測(cè)定方法》中常壓干燥法；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：按照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中微量凱氏定氮法；脂肪含量的測(cè)定：按照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》中索氏抽提法；灰分的測(cè)定：按照GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測(cè)定》中灰化法；游離氨基氮的測(cè)定：甲醛滴定法[3]，取酶解液5.00mL于200mL燒杯中，加入60mL蒸餾水，在磁力攪拌下用0.05mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2，再加入10mL中性甲醛溶液，記錄將其pH值滴至9.2時(shí)所消耗的0.05mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積，計(jì)算游離氨基氮的含量；氨基酸組成的測(cè)定：使用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定；水解度(DH)的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞骨架與雞骨渣的主要營(yíng)養(yǎng)成分分析

實(shí)驗(yàn)所用的雞骨架和雞骨渣的主要營(yíng)養(yǎng)成分分析見(jiàn)表1。Agilent 1100 Series氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定的雞骨渣的氨基酸分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 雞骨架和雞骨渣主要營(yíng)養(yǎng)成分分析Table 1 Proximate chemical composition of chicken bone and the residue left after high pressure cooking of chicken bone%

由表1可知，雞骨架經(jīng)高壓蒸煮、過(guò)濾分離后所得的雞骨渣中仍含有豐富的蛋白質(zhì)，且脂肪含量較低。灰分主要是鈣和磷，鈣和磷是人體必需的常量礦物元素，且雞骨中的鈣磷比約為2:1，是人體吸收鈣、磷的最佳比例，補(bǔ)鈣效果佳[5]。

由表2可知，對(duì)雞骨渣中組成蛋白質(zhì)的氨基酸進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)雞骨渣中含有17種氨基酸，種類齊全，其中已檢測(cè)出的7種必需氨基酸(EAA)約占氨基酸總量的37.59%，并與聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)推薦的人體理想標(biāo)準(zhǔn)[6]比較結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 雞骨渣中必需氨基酸含量與FAO標(biāo)準(zhǔn)比較Table 3 Comparison between essential amino acid composition of the residue left after high pressure cooking of chicken bone and FAO recommended counterpart %

當(dāng)食物蛋白質(zhì)必需氨基酸模式與人體蛋白質(zhì)越接近時(shí)，必需氨基酸被機(jī)體利用的程度也越高，食物蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也相對(duì)越高。由表3可知，雞骨渣中有些必需氨基酸的比例接近聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)推薦的人體理想標(biāo)準(zhǔn)。賴氨酸是主食為谷物的人群的第一限制性氨基酸，而雞骨渣中賴氨酸含量遠(yuǎn)超過(guò)FAO標(biāo)準(zhǔn)?？梢?jiàn)雞骨產(chǎn)品可與缺乏這類氨基酸的食物原料搭配食用促進(jìn)氨基酸攝入均衡[7]。

表2 雞骨渣的氨基酸組成分析Table 2 Amino acid composition of the residue left after high pressure cooking of chicken bone

2.2 蛋白酶的選用

蛋白酶對(duì)水解的肽鍵具有專一性，不同蛋白酶對(duì)同種底物的作用結(jié)果不同，生成的肽和游離氨基酸與風(fēng)味有著密切的關(guān)系[8-10]。本實(shí)驗(yàn)選用具有代表性的風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)雞骨渣進(jìn)行酶解，從水解度、酶解液的風(fēng)味等方面篩選合適的蛋白酶。4種蛋白酶的作用類型、酶活力大小及作用條件見(jiàn)表4。

表4 選用的蛋白酶的性質(zhì)和活力Table 4 Optimum reaction conditions of four proteases and corresponding maximum activities

2.3 不同蛋白酶水解雞骨渣的進(jìn)程曲線

本實(shí)驗(yàn)按1.3.2節(jié)酶解流程和表4的實(shí)驗(yàn)條件在4種酶各自的最適溫度、最適pH值及相同的加酶量(3.00g酶/kg骨渣)條件下對(duì)雞骨渣酶解5h，其各自酶解曲線見(jiàn)圖1。

圖1 4種酶在選定條件下對(duì)雞骨渣的水解度曲線Fig.1 Time courses of DH of the residue left after high pressure cooking of chicken bone by four proteases

蛋白酶的來(lái)源和組成不同，其酶學(xué)特性不同，對(duì)同一種蛋白質(zhì)的水解作用也會(huì)存在差異。由圖1可知，4種酶的水解度-時(shí)間曲線符合典型的酶反應(yīng)過(guò)程曲線，但又表現(xiàn)出各自不同的特性。在酶解30min后木瓜蛋白酶酶解物DH值已接近其DHmax，堿性和中性蛋白酶的酶解物DH值也已達(dá)到其DHmax的80%左右，而風(fēng)味蛋白酶的酶解物DH值才達(dá)到其DHmax的1/2，但低于中性蛋白酶。隨著酶解的進(jìn)行，風(fēng)味蛋白酶的酶解物DH值增大的趨勢(shì)仍然明顯，并在2.5h超過(guò)中性蛋白酶，此后其DH值就一直高于中性蛋白酶，而其他3種酶的水解速度卻變得很平緩，說(shuō)明它們對(duì)雞骨渣的水解能力較差。因此可以認(rèn)為在雞骨渣的酶解過(guò)程中，風(fēng)味蛋白酶不僅具有較高的酶活力，同時(shí)也具有較好的穩(wěn)定性。

2.4 不同蛋白酶水解雞骨渣的感官評(píng)定結(jié)果

不同蛋白酶對(duì)雞骨渣水解5h后主要水解結(jié)果見(jiàn)表5。經(jīng)感官評(píng)定，4種蛋白酶的酶解液外觀色澤都呈淡黃色，且風(fēng)味蛋白酶酶解液的澄清性狀最好；在口感上，風(fēng)味蛋白酶酶解液有明顯的雞鮮味，木瓜蛋白酶酶解液有一定的雞鮮味，堿性蛋白酶的酶解液呈弱苦味，而中性蛋白酶卻呈較強(qiáng)的苦味。呈味不同主要是酶解的位點(diǎn)不同，從而酶解出的小肽和游離氨基酸組成和數(shù)量不同，根據(jù)Ney[11]的苦味肽理論，當(dāng)肽鏈末端有較多的疏水性氨基酸時(shí)其口味一般較苦，而在風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶水解雞骨渣時(shí)，疏水性氨基酸可能仍結(jié)合在肽鏈內(nèi)部，無(wú)法游離出來(lái)與味蕾接觸，故口感較好。

表5 不同蛋白酶水解5h后的感官評(píng)定結(jié)果Table 5 Sensory characteristics of 5 h hydrolysates of the residue left after high pressure cooking of chicken bone by four proteases

2.5 不同蛋白酶水解物中游離氨基酸組成的變化

表6 不同蛋白酶水解物中游離氨基酸的組成Table 6 Amino acid composition of 5 h hydrolysates of the residue left after high pressure cooking of chicken bone by four proteases

對(duì)雞骨渣用4種蛋白酶水解5h后水解液中游離氨基酸進(jìn)行分析，由表6可知，雞骨渣和酶解液中都含有17種氨基酸(色氨酸未計(jì))，但酶解后的雞骨渣的游離氨基酸含量比酶解前的游離氨基酸的含量增多，尤其以風(fēng)味蛋白酶酶解液中游離氨基酸的增量最多，遠(yuǎn)大于其他3種蛋白酶。風(fēng)味蛋白酶酶解液中檢測(cè)出的7種必需氨基酸含量占氨基酸總量的比例為68.90%，尤其是亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸等顯著增加。另外，谷氨酸(5.09%)、甘氨酸(1.40%)、天冬氨酸(2.59%)和精氨酸(10.45%)等風(fēng)味氨基酸含量也很高，導(dǎo)致此酶解液的雞鮮味較明顯，這與前面感官評(píng)定的結(jié)果是一致的，也與趙謀明等[7]用木瓜蛋白酶水解雞肉蛋白的結(jié)果相近。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，風(fēng)味蛋白酶的水解能力強(qiáng)，酶解液的雞鮮味明顯且色澤較好，必需氨基酸含量很高，且富含多種風(fēng)味氨基酸，比較符合全面綜合利用雞骨架和實(shí)際生產(chǎn)可行性的需要，因此決定選用風(fēng)味蛋白酶來(lái)酶解雞骨渣，以作進(jìn)一步酶解工藝條件的研究。

3 結(jié) 論

雞骨架及其高壓蒸煮后的雞骨渣都具有較好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，特別是鈣磷含量高，比例適宜。對(duì)4種蛋白酶進(jìn)行水解雞骨渣的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)風(fēng)味蛋白酶不僅穩(wěn)定性好，具有較高的水解度(DH為23.15%)，且其酶解液澄清度高并具有較強(qiáng)的雞鮮味。酶解產(chǎn)物中7種必需氨基酸含量為68.90%，尤其是亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸等顯著增加，谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和精氨酸等風(fēng)味氨基酸分別占氨基酸總量的5.09%、1.40%、2.59%和10.45%，是很好的調(diào)味品基料。但其酶解工藝的優(yōu)化需進(jìn)一步研究。

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An Optimum Protease for the Hydrolysis of the Residue Left after High Pressure Cooking of Chicken Bone

XIE Zheng-jun1,2，LIU Yan2，SHEN Jing2，CHI Mei-ling2，JIN Zheng-yu1,2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

TS201.25

A

1002-6630(2010)15-0064-04

2009-12-10

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2008003)

謝正軍(1964—)，男，副教授，博士，主要從事食品資源開(kāi)發(fā)與研究。E-mail：fpcenter@jiangnan.edu.cn