蔣雪薇，羅曉明，盛燦梅，高必達(dá)

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410004)

米根霉L-乳酸發(fā)酵菌絲球形成條件的研究

蔣雪薇1,2，羅曉明2，盛燦梅2，高必達(dá)1,*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410004)

研究米根霉CS323-9在搖瓶培養(yǎng)條件下影響菌絲成球及產(chǎn)乳酸的因素?？疾?NH4)2SO4質(zhì)量濃度、接種量、搖瓶轉(zhuǎn)速及表面活性劑吐溫-80用量4個(gè)因素，再利用L9(34)的正交試驗(yàn)，對菌絲球形成及產(chǎn)酸的條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：(NH4)2SO4質(zhì)量濃度4g/L、接種量7%、搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min、吐溫-80用量0.5g/L時(shí)，搖瓶發(fā)酵菌絲球數(shù)目達(dá)115個(gè)/mL、菌絲球平均直徑為1.2mm、L-乳酸積累量為78.9g/L。說明米根霉CS323-9在搖瓶培養(yǎng)條件下菌絲球的形成與乳酸的積累有較大的相關(guān)性。

米根霉；L-乳酸；菌絲球；正交試驗(yàn)

Abstract：The effects of (NH4)2SO4 concentration, inoculum size, shake flask agitation speed and quantity of Tween-80 on the growht of Rhizopus oryzae mycelial pellets for L-lactic acid production were studied using shake flasks. Based on orthogonal array optimization, ammonium sulfate concentration of 4 g/L, inoculum size of 7% (V/V), shake flask agitation speed of 200 r/min and quantity of Tween-80 of 0.5 g/L were found optimum. The quantity of mycelial pelletswas up to 115 per milliliter after culture for 48 under these conditions, the average pellet diameter 1.2 mm and the yield of L-lactic acid 78.9 g/L. Our findings suggest that the grwoth of Rhizopus oryzae mycelial pellets is largely correlated with L-lactic acid production.

Key words：Rhizopus oryzae；L-lactic acid；mycelial pellets；orthogonal array design

乳酸又名2-羥基丙酸(2-hydroxy propanoic acid)，是具有光學(xué)活性的最小分子之一，具有D-型、L-型和DL-型3種構(gòu)型，能廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化學(xué)工業(yè)[1]。特別是近些年發(fā)現(xiàn)L-乳酸聚合形成的聚L-乳酸(PLA)具有可生物降解性以后，L-乳酸發(fā)酵呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景[2-4]。米根霉因其能發(fā)酵積累高光學(xué)活性的L-乳酸而成為乳酸發(fā)酵的重要生產(chǎn)菌株。與細(xì)菌發(fā)酵不一樣的是，米根霉是好氧發(fā)酵，需要有適當(dāng)?shù)娜芙庋醪拍芊e累乳酸。而米根霉在液體深層發(fā)酵中的菌絲形態(tài)多數(shù)情況下是以大塊菌絲團(tuán)為主，這阻礙了氧的傳遞，對菌體的生物量及乳酸的積累都會(huì)有影響[5]。因此，研究發(fā)酵過程中菌體的形態(tài)變得尤為重要。

根霉在液體培養(yǎng)下菌體會(huì)呈現(xiàn)菌絲團(tuán)塊、菌絲和菌絲球等生長形態(tài)，這些復(fù)雜的生長形態(tài)不光影響發(fā)酵液中氧的溶解，還會(huì)使發(fā)酵控制變得比較復(fù)雜且不易掌握，難以建立合理的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型[6-7]。根霉在某些情況下會(huì)自聚集成球，這種生長狀態(tài)有利于改善發(fā)酵液的流變學(xué)特性，能促進(jìn)溶氧及菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝，進(jìn)而提高產(chǎn)酸。根霉在自聚集成球的狀態(tài)下，其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特性較菌絲體簡單，便于模擬；另外，成球的根霉還有利于菌體的固定化，對研究固定化連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸具有極其重要的意義[8-10]。本實(shí)驗(yàn)研究米根霉搖瓶發(fā)酵中影響菌絲球形成的一些因素，對于乳酸液體深層發(fā)酵中如何改善菌絲形態(tài)有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

米根霉(Rhizopus oryzae)CS323-9，由長沙理工大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基；麩皮培養(yǎng)基：麩皮按質(zhì)量比1:1加水混勻后，取50g裝入500mL的三角瓶；搖瓶培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖110、(NH4)2SO42、KH2PO40.6、MgSO40.25、ZnSO40.088、CaCO310，pH值自然。以上培養(yǎng)基均采用121℃、20min濕熱滅菌；其中CaCO3在150℃、2h干熱滅菌后加入。

斜面培養(yǎng)：28℃、2～3d；麩曲培養(yǎng)：28℃、7d，制備1012個(gè)/mL的孢子懸液作為接種物；搖瓶培養(yǎng)：250mL的三角瓶中裝入50mL液體培養(yǎng)基，接種孢子懸液，28℃、160～240r/min培養(yǎng)48h。

1.3 分析方法[11]

還原糖：菲林滴定法；L-乳酸：EDTA定鈣法；總酸：酸堿滴定法。

1.4 菌絲球的計(jì)數(shù)及球徑的測定

采用計(jì)數(shù)器計(jì)出肉眼可見的菌絲球；隨機(jī)取20個(gè)菌絲球，側(cè)出球體的直徑，然后求出平均值。

1.5 菌體生物量的測定

采用烘干法[11]。取一定量發(fā)酵液過濾得菌絲，蒸餾水充分洗滌除去菌絲上包裹的CaCO3，105℃烘至質(zhì)量恒定并稱量。

1.6 菌絲球形成及產(chǎn)酸條件的優(yōu)化

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對菌絲球形成及產(chǎn)酸影響較大的4個(gè)重要因素：(NH4)2SO4質(zhì)量濃度、接種量、搖瓶轉(zhuǎn)速、吐溫-80用量為考察對象，開展單因素試驗(yàn)，單因素考察變量以外的其他條件為：(NH4)2SO42g/L、接種量6%(V/V)、搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min、吐溫-80用量0g/L，28℃，培養(yǎng)48h。在此基礎(chǔ)上采用L9(34)的正交設(shè)計(jì)，進(jìn)一步考察各因素之間的協(xié)同作用，確定最佳菌絲成球及產(chǎn)酸條件，其因素水平表見表1。

表1 L9(34)因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度的(NH4)2SO4對菌絲成球及產(chǎn)酸的影響

(NH4)2SO4是一種速效氮源，又是一種生理酸性鹽，其被利用后培養(yǎng)的pH值會(huì)有所降低，而在微酸性條件下L-乳酸的積累水平較高，因此，以(NH4)2SO4作為氮源，有利于菌絲生長及L-乳酸積累[12]。故研究了不同質(zhì)量濃度的(NH4)2SO4對米根霉CS323-9的菌絲成球及產(chǎn)酸的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同(NH4)2SO4質(zhì)量濃度對菌絲成球(a)和發(fā)酵指數(shù)(b)的影響Fig.1 Effect of (NH4)2SO4concentration on the growth of Rhizopus oryzae mycelial pellets and fermentation parameters

從圖1a可以看出，隨著(NH4)2SO4質(zhì)量濃度的增大，菌絲球數(shù)目會(huì)出現(xiàn)較大的增幅，當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量濃度達(dá)4g/L時(shí)，菌絲球數(shù)目達(dá)到最大，最后降為0(菌絲形成菌絲團(tuán)塊及絮狀物，均計(jì)菌絲球數(shù)目為0)。

從圖1b可知，當(dāng)菌絲球數(shù)目達(dá)到最高值時(shí)，L-乳酸積累量也達(dá)到了較高水平，此時(shí)還原糖最低，同時(shí)生物量也達(dá)到較高的水平，但隨著(NH4)2SO4質(zhì)量濃度的進(jìn)一步升高，在生物量保持較高水平時(shí)，總酸維持較高水平的同時(shí)L-乳酸的積累量卻下降了。其原因可能與(NH4)2SO4是速效氮源，當(dāng)質(zhì)量濃度在一定的范圍內(nèi)增大時(shí)，有利于促進(jìn)菌絲生長，孢子聚集成團(tuán)時(shí)，先萌發(fā)的菌絲由于生長迅速，將后萌發(fā)的孢子包裹在菌絲團(tuán)中，就形成菌絲球；當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量濃度過大時(shí)，菌絲生長速度快且量多，故而容易形成菌絲團(tuán)塊，過大的菌絲團(tuán)塊會(huì)使其核心的菌絲在營養(yǎng)物質(zhì)及溶氧的傳遞上出現(xiàn)困難，反而抑制了L-乳酸的積累，轉(zhuǎn)為積累雜酸，致使乳酸產(chǎn)量急劇下降。因此，最佳的(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為4g/L。

2.2 不同接種量對菌絲成球及產(chǎn)酸的影響

圖2 不同接種量對菌絲成球(a)和發(fā)酵指數(shù)(b)的影響Fig.2 Effect of inoculum size on the growth of Rhizopus oryzae mycelial pellets and fermentation parameters

由圖2可知，接種量對菌絲球的形成及發(fā)酵周期都有很大影響[9]。接種量從5%增加到9%時(shí)，菌絲球數(shù)目及產(chǎn)酸到7%時(shí)同時(shí)達(dá)到最高。當(dāng)接種量比較小時(shí)，菌絲球大而疏松，且菌絲球數(shù)少，當(dāng)接種量為9%時(shí)，菌體大量生長，但菌絲球極小，僅肉眼能見，同時(shí)有大量的菌絲體存在，培養(yǎng)液呈現(xiàn)絮粥狀，菌體與培養(yǎng)液很難分離；接種量為7%時(shí)，菌絲成球數(shù)最大，且球體致密均勻，生物量也最大。這主要是因?yàn)榻臃N量低時(shí)，單位體積的孢子數(shù)目少，導(dǎo)致聚集的孢子團(tuán)較少，形成的菌絲核心也就少，加之生成的菌絲量少，所以每個(gè)核心上纏繞的菌絲也就少，故最終菌絲成球數(shù)少；相反，適當(dāng)提高接種量，形成的孢子團(tuán)多，菌絲核心也多，每個(gè)核心上纏繞的菌絲相對來說比較多，因而形成均勻致密的菌絲球。接種量過大時(shí)，菌絲之間競爭生長空間[6]，則容易給成球造成干擾，反而使菌絲球數(shù)目減少。接種量為7%時(shí)，菌絲球數(shù)目最大且L-乳酸產(chǎn)生量最大，故最佳接種量為7%。

2.3 不同搖瓶轉(zhuǎn)速對菌絲成球及產(chǎn)酸的影響

米根霉L-(+)-乳酸發(fā)酵屬好氧發(fā)酵，為進(jìn)一步考察菌絲成球及產(chǎn)酸與氧的需求的關(guān)系，研究了回旋式搖床在160～240r/min之間5種不同搖瓶轉(zhuǎn)速對菌絲成球及產(chǎn)酸的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3a可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速小于200r/min時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加，其菌絲成球數(shù)略有增加。轉(zhuǎn)速較低時(shí)，形成的菌絲球因自重而沉降，且菌絲球間相互交聯(lián)，因而形成不規(guī)則的絮狀菌絲帶；當(dāng)轉(zhuǎn)速為200r/min時(shí)，菌絲成球數(shù)達(dá)最大值；當(dāng)轉(zhuǎn)速大于220r/min時(shí)，由于轉(zhuǎn)速過大，大量菌絲互相纏繞，不利于成球，導(dǎo)致成球數(shù)相對于200r/min來說要少很多。

圖3 不同搖瓶轉(zhuǎn)速對菌絲成球(a)和發(fā)酵指數(shù)(b)的影響Fig.3 Effect of shake flask agitation speed on the growth of Rhizopus oryzae mycelial pellets and fermentation parameters

由圖3b可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到240r/min時(shí)，L-乳酸積累量急劇下降，總酸也略有降低，而還原糖則維持較高水平，同時(shí)生物量也處于較低水平。說明盡管米根霉L-(+)-乳酸發(fā)酵是好氧的，但不是通氣量越大越好，通氣過大一方面葡萄糖代謝旺盛，TCA循環(huán)加強(qiáng)，富馬酸等代謝副產(chǎn)物增多[13]；另一方面會(huì)增加乳酸的氧化分解，產(chǎn)生其他副產(chǎn)物，導(dǎo)致總酸下降。因此，有利于菌絲成球及產(chǎn)酸的最佳轉(zhuǎn)速為200r/min。

2.4 不同表面活性劑添加量對菌絲成球及產(chǎn)酸的影響

發(fā)酵液中適量添加表面活性劑可以改變發(fā)酵液流變學(xué)特性[7]。由前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)非離子型表面活性劑吐溫-80在培養(yǎng)過程中有利于改善菌絲的形態(tài)及產(chǎn)酸。故考察了添加不同量的吐溫-80時(shí)，搖瓶發(fā)酵菌絲球形成及產(chǎn)酸的情況，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)吐溫-80的添加量為1g/L時(shí)，菌絲球的數(shù)目達(dá)到最大，且產(chǎn)酸最高、還原糖最低，但當(dāng)吐溫-80的添加量進(jìn)一步增加時(shí)(＞1g/L)，總酸及L-乳酸積累量下降較大，還原糖量較高且生物量也有所減少。這可能與吐溫-80是非離子型表面活性劑，能改變發(fā)酵液中孢子和菌絲球液膜表面張力，可適度消除菌絲成團(tuán)的障礙，有利于孢子和菌絲聚集成球；添加量較高時(shí)，容易導(dǎo)致孢子過多聚集，萌發(fā)時(shí)形成菌絲團(tuán)塊，而不易成球，致使發(fā)酵液流變學(xué)特性變化，不利于產(chǎn)物積累。因此，吐溫-80的最佳添加量為1g/L。

圖4 吐溫-80的用量對菌絲成球(a)和發(fā)酵指數(shù)(b)的影響Fig.4 Effect of quantity of Tween-80 on the growth of Rhizopus oryzae mycelial pellets and fermentation parameters

2.5 正交試驗(yàn)確定最佳菌絲成球及產(chǎn)酸條件

以上研究了幾個(gè)對菌絲成球影響較大的單一因素，但是，單因素試驗(yàn)不能很好地反映出各因素之間的相互作用關(guān)系，為進(jìn)一步對米根霉CS323-9的菌絲成球及產(chǎn)酸條件進(jìn)行優(yōu)化，選用L9(34)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果[8]Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

從表2可以看出，通過直觀分析：各因素對L-乳酸積累量影響的主次順序是D＞A＞C＞B；對于菌絲球數(shù)，其影響次序?yàn)镈＞C＞B＞A。菌絲球數(shù)的結(jié)果差異相當(dāng)大，尤其是試驗(yàn)號(hào)1、3、9，菌絲球的形成很少甚至沒有，菌絲主要以團(tuán)塊或絮狀物的形式存在。菌絲團(tuán)塊使菌絲內(nèi)部的營養(yǎng)物質(zhì)及氧的供給受到限制，菌絲生長僅局限于表面，使參與發(fā)酵的生物量減少，從而影響產(chǎn)物積累；而絮狀菌絲在攪拌發(fā)酵過程中容易被打斷，致使發(fā)酵液黏度升高，也會(huì)影響傳質(zhì)[14-15]。米根霉L-乳酸發(fā)酵對于營養(yǎng)物質(zhì)及氧的傳遞比較敏感，條件控制不好時(shí)容易產(chǎn)生過多的乙醇、富馬酸等副產(chǎn)物，影響L-乳酸的積累。而菌絲的形態(tài)直接影響了發(fā)酵液的流變學(xué)特性和發(fā)酵過程的傳質(zhì)效能，進(jìn)而影響乳酸的生成和糖的消耗速率等重要發(fā)酵指標(biāo)。因此，菌絲球數(shù)的多少與產(chǎn)酸有著較大的協(xié)同關(guān)系，可以看出，菌絲球數(shù)較少或沒有的L-乳酸積累量也相對較低，而菌絲球數(shù)目較多的其L-乳酸的積累量也明顯高于前者?；诮z狀菌發(fā)酵中菌絲形態(tài)的變化對于發(fā)酵指標(biāo)變化的重要影響，選取以菌絲球數(shù)為指標(biāo)的分析結(jié)果確定其影響的主次順序，其最佳條件組合為D2C2B2A2，即吐溫-80用量0.5g/L、搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min、接種量7%、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度4g/L。

4個(gè)因素中表面活性劑吐溫-80的用量無論是對于L-乳酸積累還是產(chǎn)物形成都有著較大的影響，這可能與吐溫-80能有效改變發(fā)酵液的表面張力，從而改變?nèi)苎跫版咦泳奂潭扔嘘P(guān)。影響L-乳酸積累量的第二因素是(NH4)2SO4質(zhì)量濃度，這可能與(NH4)2SO4對菌絲生長有較大的影響有關(guān)，(NH4)2SO4質(zhì)量濃度較高時(shí)，所獲生物量也較高，L-乳酸是生長偶聯(lián)型發(fā)酵，生物量較高時(shí)，L-乳酸積累量也隨之提高；而影響菌絲成球的第二因素則是搖瓶轉(zhuǎn)速，搖瓶轉(zhuǎn)速對孢子萌發(fā)后不斷延長的菌絲的纏繞形式有較大的影響，從而影響菌絲的形態(tài)。綜合考慮，在生物量較大、菌絲成球數(shù)目較多時(shí)，L-乳酸積累量比較高，可以說，菌絲形態(tài)對于米根霉L-乳酸發(fā)酵來說也是一個(gè)非常重要的因素。

2.6 最優(yōu)條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

圖5 試驗(yàn)號(hào)4(a)和最優(yōu)化條件(b)實(shí)驗(yàn)的菌絲球形態(tài)Fig.5 Comparison of morphological pictures of Rhizopus oryzae mycelial pellets formed under different culture conditions: a. run 4 (see Table 2); b. ammonium sulfate concentration of 4 g/L, inoculum size of 7% (V/V), shake flask agitation speed of 200 r/min and quantity of Tween-80 of 0.5 g/L

以正交試驗(yàn)所得的最優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，搖瓶發(fā)酵平均產(chǎn)L-乳酸為78.9g/L，菌絲球生成數(shù)目為115個(gè)/mL，其菌絲球形態(tài)與正交試驗(yàn)4號(hào)試驗(yàn)組對比見圖5。兩組實(shí)驗(yàn)所得的產(chǎn)酸都比較高，且菌絲球形成數(shù)目也較高，從試驗(yàn)號(hào)4的照片(圖5a)可以看出其菌絲球直徑較大，平均達(dá)3.3mm，培養(yǎng)基中除菌絲球外還有少量絮狀的菌絲體，而最優(yōu)條件下的實(shí)驗(yàn)照片(圖5b)則菌絲體較少，球的直徑較小，平均為1.2mm，且菌絲球較4號(hào)致密，發(fā)酵液比較清稀，這樣的培養(yǎng)液有利于營養(yǎng)物質(zhì)及氧的傳遞，因而產(chǎn)酸有所提升。

3 結(jié) 論

3.1 研究了菌絲成球的影響因素，并探討了菌絲成球與L-乳酸的積累關(guān)系，研究證明，菌絲球的形成有助于改善發(fā)酵液的流變學(xué)特性，有利于氧及營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，從而有利于產(chǎn)酸。

3.2 促進(jìn)菌絲球形成及搖瓶產(chǎn)酸的最佳條件：吐溫-80用量0.5g/L、搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min、接種量7%、(NH4)2SO4質(zhì)量濃度4g/L。其中吐溫-80用量及搖瓶轉(zhuǎn)速對菌絲球形成及產(chǎn)酸都有比較大的影響。在此條件下平均產(chǎn)酸達(dá)78.9g/L，菌絲球數(shù)目為115個(gè)/mL，球體平均直徑為1.2mm。

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Effects of Culture Conditions of Mycelial Pellet Formation and L-Lactic Acid Production by Rhizopus oryzae

JIANG Xue-wei1,2，LUO Xiao-ming2，SHENG Can-mei2，GAO Bi-da1,*
(1. College of Bio-safety Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China；2. College of Chemical and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410004, China)

TQ921.3

A

1002-6630(2010)15-0216-05

2010-05-07

湖南省教育廳資助項(xiàng)目(06C090)；微生物分子生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(MM0802)

蔣雪薇(1972—)，女，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)楣I(yè)微生物發(fā)酵及食品生物技術(shù)。E-mail：jxw_72@sina.com

*通信作者：高必達(dá)(1952—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。E-mail：bdgao@yahoo.com.cn