柳 嘉， David G. Popovich，景 浩,*

(1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2. 新加坡國立大學化學系，新加坡 117543)

篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細胞生長的抑制作用

柳 嘉1， David G. Popovich2，景 浩1,*

(1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2. 新加坡國立大學化學系，新加坡 117543)

目的：研究篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細胞生長抑制作用及其作用機理。方法：采用MTT法觀察細胞生長抑制并確定半數抑制濃度(IC50)，LDH(lactate dehydrogenase)法評價提取物引起的細胞膜損傷，流式細胞計法測定細胞周期，熒光顯微鏡觀察凋亡細胞的形態(tài)學特征。結果：篤斯越橘花青素提取物能夠有效地抑制3T3-L1前脂肪細胞的生長且IC50約為214μg/mL；LDH實驗表明細胞LDH釋放率在24、48、72h分別為89.0%、85.2%、67.8%，72h時相對24h或48h明顯降低(P＜0.05)，提取物對3T3-L1前脂肪細胞膜的通透性未見明顯增加；篤斯越橘花青素提取物能夠有效誘導細胞凋亡，同時在S或G0/G1期產生阻滯，但是對細胞的G2/M期未見明顯影響，熒光顯微鏡觀察細胞出現典型凋亡特征。結論：篤斯越橘花青素提取物能有效抑制3T3-L1前脂肪細胞生長的作用，具有開發(fā)為天然抗肥胖功能因子的潛在可能。

篤斯越橘花青素提取物；3T3-L1前脂肪細胞；生長抑制；細胞凋亡

篤斯越橘(Vaccinium uliginosum L.)是我國最主要的越橘屬植物之一，其果實富含黃酮類物質，如花青素[1]、原花青素[2]、楊梅黃素[3]等。每100g篤斯越橘鮮果中花青素含量達343mg，是紅豆越橘的兩倍[4]。研究發(fā)現，花青素具有多種生物活性和藥物功能，如抗氧化[5]以及抑制癌細胞生長和誘導細胞凋亡[6]等作用。花青素減肥功效的研究在近幾年成為熱點[7-8]，抑制肥胖的主要途徑包括減少能量攝入，增加能量支出，減少前脂肪細胞分化和增殖，減少脂肪細胞脂肪合成，增加脂肪分解和氧化等。前脂肪細胞可轉化成為成熟脂肪細胞并增加脂肪組織，因此抑制前脂肪細胞生長是抗肥胖非常重要的一個途徑[9]。本研究從篤斯越橘花青素提取物抑制細胞增殖、改變細胞膜通透性和引起細胞凋亡角度，研究篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細胞增殖的抑制作用。以期為進一步開發(fā)和綜合利用篤斯越橘資源提供有益的信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篤斯越橘花青素提取物(bog bilberry anthocyanin extract，BBAE；花青素含量為25%) 大興安嶺華野生物工程有限公司；Swiss小鼠3T3-L1前脂肪細胞細胞株ATCC公司。

胎牛血清(FBS)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 新加坡1st Base公司；十二烷基磺酸鈉(SDS) 國藥控股沈陽有限公司；DMEM培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑藍(MTT)、碘化丙啶(PI)、輔酶I(NADH)、丙酮酸鈉 Sigma公司；0.04%臺盼藍溶液 美國MP Biomedicals公司；青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%， EDTA 0.52 mmol/L) 加拿大Gibco公司；細胞周期反應液 美國Guava科技公司；其他試劑均為進口分析純。

1.2 儀器與設備

全波長酶標儀 美國熱電集團；BIO-RAD680酶標儀 美國伯樂公司；倒置顯微鏡、CX3生物顯微鏡、C-5060數碼相機 日本Olympus公司；PCA流式細胞計 美國Guava科技公司。

1.33 T3 -L1前脂肪細胞的細胞培養(yǎng)

細胞在含有10%胎牛血清、100U/L青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中(以下簡稱DMEM10)，于37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)。當細胞生長至80%～90%融合時，用胰蛋白酶-EDTA溶液化細胞。

1.4 MTT實驗

取9 6孔培養(yǎng)板，每孔加入100μL細胞懸液，3T3-L1前脂肪細胞為2.5×104個/mL。96孔板放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)。24h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL含有不同質量濃度的篤斯越橘花青素提取物的培養(yǎng)液(150～1500μg/mL)，以不含有樣品的DMEM10為空白對照，溫箱孵育72h。除去培養(yǎng)液后，加入含有0.5mg/mL MTT的DMEM10培養(yǎng)基孵育4h，再加入100μL的0.1g/mL SDS(含0.1mol/L HCl)溶液過夜，以完全溶解出MTT紫色結晶產物。用酶標儀在570nm處(以630nm為參考波長)測定光密度值。實驗重復3次。以藥物濃度的對數與細胞存活率進行直線回歸并求出 IC50(半數抑制濃度，即細胞存活率為50%時所需要的提取物的濃度)[10]。

1.5 乳酸脫氫酶釋放量檢測

取24孔培養(yǎng)板，每孔加入1mL 3T3-L1前脂肪細胞懸液，濃度為5×104個/mL。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入1mL含有相應IC50的篤斯越橘花青素提取物的培養(yǎng)液，以不含有樣品的DMEM10為空白對照，分別于24、48、72h收集上清液，500×g離心10min。取50μL離心后的上清液與2mL的Tris-EDTA-NADH溶液(含有50mmol/L Tris緩沖液，pH 7.4，37℃；5mmol/L EDTA；150μmol/L NADH)混合，溫箱孵育12min，再加入200μL預熱(37℃)過的13.5mmol/L丙酮酸鈉溶液，混合均勻，于37℃、340nm波長用酶標儀測定3min內每分鐘OD值的下降數值(ΔOD值)。實驗重復3次，3個平行測定。結果以LDH(lactate dehydrogenase)釋放率(樣品LDH釋放量與對照LDH釋放量之比)表示。每分鐘的ΔOD值下降率是每分鐘樣品ΔOD值與對照ΔOD值的比值，LDH釋放率則為3min內每分鐘ΔOD值下降率之和的均值[10]。

1.6 細胞周期及細胞凋亡測定

取24孔培養(yǎng)板，每孔加入1mL 3T3-L1前脂肪細胞懸液，濃度為5×104個/mL。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入1mL含有相應IC50的篤斯越橘提取物的培養(yǎng)液孵育，以不含有樣品的DMEM10為空白對照，實驗重復3次，3個平行測定。分別于24、48、72h棄去培養(yǎng)液， 用1mL PBS溶液清洗細胞層，洗液收集至離心管中。每孔加入500μL 胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱內消化10min，加入1mL DMEM10培養(yǎng)液終止反應，將細胞懸液打勻后加入離心管中。以1mL PBS溶液清洗各孔，洗液收集至離心管中。離心管于500×g離心5min。小心吸去上清液，用1mL PBS溶液打勻細胞并500×g離心5 min，重復一次。去除上清液后，邊劇烈振蕩邊向細胞沉淀中逐滴加入1mL預冷至－20℃的70%乙醇。置于4℃過夜。過夜后的溶液于500×g離心5min，小心吸去上清液，用1mL PBS溶液打勻細胞并500×g離心5min，重復一次。 去除上清液后， 加入200μL Guava細胞周期反應液并打勻。避光室溫放置30min。于流式細胞計檢測細胞周期，用Guava CytoSoft軟件處理數據。

1.7 熒光顯微鏡觀察

取94mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞，濃度為5×104個/皿， 貼壁培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，向皿中加入5mL含有相應IC50的篤斯越橘提取物的培養(yǎng)液，以不含有樣品的DMEM10為空白對照。孵育72h后棄去培養(yǎng)液， 用5mL PBS溶液輕柔清洗細胞層，重復一次。緩慢加入5mL的質量分數3.7%福爾馬林，覆蓋細胞層，室溫放置15min。去除福爾馬林后，用5mL PBS溶液輕柔清洗細胞層，重復一次。 緩慢加入5mL預冷至－20℃甲醇，覆蓋細胞，室溫放置5min。去除甲醇，用5mL PBS溶液輕柔清洗細胞層2次。避光緩慢加入3mL的50 μg/mL PI染液，溫箱孵育30min。去除染液后，用PBS溶液輕柔清洗細胞層2次，于超凈臺上放置直至干燥。于熒光顯微鏡下放大400倍觀察細胞。

1.8 統(tǒng)計分析

每個實驗重復3次，結果以x±s表示。LDH數據結果采用SPSS12.0軟件進行One-Way ANOVA分析，鄧肯氏多重檢驗用來確定數據間的顯著性差異，顯著水平設定為P＜0.05；細胞周期數據組間結果(兩組數據)采用兩組資料的t檢驗，顯著水平設定為P＜0.05 。

2 結果與分析

2.1 篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細胞的生長抑制

圖1 篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細胞生長抑制作用的劑量效應關系Fig.1 Cell growth inhibition effect of BBAE on 3T3-L1 preadipocytes

由圖1可知，篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細胞有明顯生長抑制作用。隨著篤斯越橘花青素提取物質量濃度的升高(150～900μg/mL)，其抑制細胞生長的能力增強，劑量效應關系明顯，細胞存活率從約100%降至10%。當提取物質量濃度介于900～1500μg/mL時，細胞存活率基本不變。以細胞存活率與提取物質量濃度的對數進行直線回歸并求出IC50。經計算，篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細胞生長抑制的IC50為(213.9 ± 19.6)μg/mL。

2.2 3T3-L1前脂肪細胞的LDH釋放量檢測

圖2顯示出3T3-L1前脂肪細胞LDH釋放率與時間的關系。經處理24、48、72h LDH釋放率分別為89.0%、85.2%、67.8%，48h和72h相對24h時分別減少了4%和21%。3T3-L1前脂肪細胞在3個時間段LDH釋放率均低于100%，說明處理組和對照組相比沒有更多的LDH釋放，即篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細胞細胞膜通透性未見明顯變化。經統(tǒng)計分析，處理48h的3T3-L1前脂肪細胞LDH釋放率與24h相比無明顯差異，但72h與24h或48h相比均有明顯降低(P＜0.05)。研究原始數據發(fā)現(未列出)，對照組細胞的LDH釋放量隨時間延長緩慢增長，但處理組細胞的LDH釋放量基本保持不變，導致72h時細胞LDH釋放率有顯著減少。

圖2 3T3-L1前脂肪細胞LDH釋放率Fig.2 LDH activity in 3T3-L1 preadipocytes after incubation for different periods of time in the presence of BBAE

2.3 3T3-L1前脂肪細胞的細胞周期變化

經過相應的IC50篤斯越橘花青素提取物處理，3T3-L1前脂肪細胞分別在24、48、72h于流式計上測定細胞周期的變化。用Guava CytoSoft軟件進行細胞周期分析，表1為3T3-L1前脂肪細胞空白對照組和處理組細胞各個時期細胞組成的比例。每個時間段Sub-G1期的細胞，處理組均多于對照組；且隨時間的增加(24～72h)，處理組的Sub-G1期即凋亡細胞明顯增多，24h至72h凋亡細胞比例從1%上升至14%；G2/M期細胞數量則未見明顯變化；72h時G0/G1期細胞數量明顯減少(P＜0.05)；24h時S期細胞數量顯著下降(P＜0.05)，72h時則增多(P＜0.05)。 篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細胞有生長抑制作用，但沒有明顯改變細胞膜的通透性，卻改變了細胞周期，誘導了細胞凋亡。

表1 3T3-L1前脂肪細胞細胞周期的變化Table 1 Cell cycle distribution of 3T3-L1 preadipocytes after incubation for different periods of time in the presence of BBAE

2.4 3T3-L1前脂肪細胞的細胞形態(tài)觀察

圖3 篤斯越桔花青素提取物對3T3-L1前脂肪細胞細胞形態(tài)的影響(×400)Fig.3 Morphological micrographs of 3T3-L1 preadipocytes after incubation for 72 h with and without the presence of BBAE (×400)

將處理72h的3T3-L1前脂肪細胞固定并染色，利用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)，如圖3所示。對照組的細胞完整，細胞核集中，生長狀況良好。而處理組的細胞相對分散，細胞數量減少，細胞體積變大，細胞間連接基本消失，失去纖維狀形態(tài)；細胞核內具有典型的凋亡細胞形態(tài)特征：如細胞核固縮、體積縮小，核染色質邊集聚，凝聚成大小不同的塊，斷裂分散到細胞質中，可見致密濃染的黃色熒光。

3 討 論

研究表明，篤斯越橘花青素提取物對Swiss小鼠前脂肪細胞3T3-L1有明顯的生長抑制作用，且呈劑量效應。對其生長抑制機理進行研究發(fā)現，3T3-L1前脂肪細胞經篤斯越橘花青素提取物處理后，LDH釋放率在24h和48h沒有增加，在72h減少，表明篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細胞產生的抑制作用，不是由改變細胞膜通透性途徑實現的。Fantinelli等[11]用無酒精的阿根廷紅酒花青素對Wistar大鼠心臟進行缺血再灌注損傷，與對照組相比L D H釋放量較對照組降低。Marcollet等[12]用越橘花青素喂養(yǎng)SD大鼠，3min后發(fā)現血漿中的LDH釋放量較對照組小。這些報道與本研究結果相一致，表明篤斯越橘花青素提取物不是通過改變細胞膜通透性途徑抑制3T3-L1前脂肪細胞的生長，可能是通過直接和LDH結合改變3T3-L1前脂肪細胞的細胞膜性質[13]。提取物對3T3-L1前脂肪細胞細胞膜性質的影響有待進一步研究。

本實驗結果顯示，篤斯越橘花青素提取物能夠有效誘導3T3-L1前脂肪細胞的細胞凋亡，細胞周期Sub-G1期凋亡細胞量有顯著提高(P＜0.05)，呈時間效應，細胞形態(tài)出現典型凋亡特征。由于前脂肪細胞可轉化成為成熟脂肪細胞，因此抑制前脂肪細胞生長是抗肥胖的一個重要途徑[9]。有研究顯示，一些天然產物可以抑制3T3-L1前脂肪細胞的生長并誘導細胞凋亡，如蘆丁、柚皮素、柚皮苷、橙皮苷、白藜蘆醇和染料木黃酮等[14-15]。篤斯越橘花青素提取物能有效抑制前脂肪細胞生長并誘導其凋亡，因此具有開發(fā)為抗肥胖食品的潛力。

近幾年發(fā)現，天然產物誘導前脂肪細胞凋亡存在多種途徑。槲皮素可通過降低線粒體膜電位，減少多聚(ADP-核糖)聚合酶合成等途徑誘導3T3-L1前脂肪細胞凋亡[16]。茶多酚可以影響細胞周期蛋白激酶CDK2表達，最終抑制細胞有絲分裂[17]。辣椒素通過激發(fā)半胱氨酸蛋白酶-3等途徑抑制前脂肪細胞生長并誘導產生大量凋亡細胞[18]。篤斯越橘花青素提取物誘導3T3-L1前脂肪細胞的細胞凋亡的途徑有待進一步的研究。

綜合MTT和LDH實驗結果，篤斯越橘花青素提取物對3T3-L1前脂肪細胞有生長抑制作用，其生長抑制機理不是通過改變細胞膜的通透性，而是通過改變細胞周期并誘導了細胞凋亡，從而達到對3T3-L1細胞的生長抑制效果。

4 結 論

篤斯越橘花青素提取物對Swiss小鼠前脂肪細胞3T3-L1有明顯的生長抑制作用，且呈劑量效應，IC50約為214μg/mL。

經篤斯越橘花青素提取物處理后，3T3-L1細胞的LDH釋放率沒有增加(24～48h)，反而在72h有減少。細胞生長抑制作用不是通過提取物改變細胞膜通透性實現的。

篤斯越橘花青素提取物能夠有效誘導3T3-L1細胞細胞凋亡，細胞周期Sub-G1期凋亡細胞量有顯著提高(P＜0.05)， 細胞形態(tài)出現典型細胞凋亡特征。

[1]JIAO Hongjun, WANG S Y. Correlation of antioxidant capacities to oxygen radical scavenging enzyme activities in blackberry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48: 5672-5676.

[2]張興茂, 林松毅, 劉靜波, 等. 長白山篤斯越橘果實原花青素浸提工藝的研究[J]. 食品科學, 2007, 28(11): 186-189.

[3]楊桂霞, 范海林, 鄭毅男, 等. 篤斯越橘果實中黃酮類化合物的分離鑒定[J]. 吉林農業(yè)大學學報, 2005, 27(6): 643-644.

[4]孟凡麗. 越橘果實中花色苷的提取分離、定量和結構鑒定研究[D].長春: 吉林農業(yè)大學, 2003.

[5]ASTADI I R, ASTUTI M, SANTOSO U, et al. In vitro antioxidant activity of anthocyanins of black soybean seed coat in human low density lipoprotein (LDL)[J]. Food Chemistry, 2009, 112: 659-663.

[6]LIU M, LI X Q, WEBER C, et al. Antioxidant and antiproliferative activities of raspberries[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50: 2926-2930.

[7]TSUDA T, UENO Y, KOJO H, et al. Microarray profiling of gene expression in human adipocytes in response to anthocyanins[J]. Biochemical Pharmacology, 2006, 71: 1184-1197.

[8]MOLAN A L, LILA M A, MAWSON J. Satiety in rats following blueberry extract consumption induced by appetite-suppressing mecha-nisms unrelated to in vitro or in vivo antioxidant capacity[J]. Food Chemistry, 2008, 107: 1039-1044.

[9]WANG Y W, JONES P J. Conjugated linolic acid and obesity control: efficacy and mechanisms[J]. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders, 2004, 28: 941-955.

[10]JING H, KITTS D D. Antioxidant activity of sugar-lysine Maillard reaction products in cell free and cell culture systems[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2004, 429: 154-163.

[11]FANTINELLI J C, SCHINELLA G, CINGOLANI H E, et al. Effects of different fractions of a red wine non-alcoholic extract on ischemia-reperfusion injury[J]. Life Science, 2005, 76(23): 2721-2733.

[12]MARCOLLET M, BASTIDE P, TRONCHE P. Effect angio-protecteur des anthocyanosides de Vaccinium myrtillus objectivevis-à-vis de la liberération de la lactate deshydrogenase (LDH) et de ses isoenzymes cardiaques chez le rat soumisauneepreuve de nage[J]. Socie té De Biologie De Clermont-Ferrand, 1969, 163: 1786-1789.

[13]DANPURE C J. Lactate dehydrogenase and cell injury[J]. Cell Biochemistry and Functinon, 1984, 2(3):144-148.

[14]HSU C L, HUANG S L, YEN G C. Inhibitory effect of phenolic acids on the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes in relation to their antioxidant activity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54: 4191-4197.

[15]HARMON A, HARP J. Differential effects of flavonoids on 3T3-L1 adipogenesis and lipolysis[J]. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 2001, 280: 807-813.

[16]HSU C L, YEN G C. Induction of cell apoptosis in 3T3-L1 preadipocytes by flavonoids is associated with their antioxidant activity[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2006, 50(11): 1072-1079.

[17]KAO Y H, HIIPAKKA R A, LIAO S. Modulation of obesity by a green tea catechin[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 2000, 72: 1232-1234.

[18]HSU C L, YEN G C. Effects of capsaicin on induction of apoptosis and inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 cells[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55:1730-1736.

Growth Inhibition Effect of Bog Bilberry Anthocyanin Extract on 3T3-L1 Preadipocytes

LIU Jia1，David G. Popovich2，JING Hao1,*
( 1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；
2. Department of Chemistry, National University of Singapore, Singapore 117543, Singapore)

Objective: To study the inhibition effect and its mechanism of bog bilberry (Vaccinium uliginosum L.) anthocyanin extract (BBAE) on the growth of 3T3-L1 preadipocytes. Methods: MTT assay, LDH (lactate dehydrogenase) assay, flow cytometry and fluorescence microscope were used for measuring cell growth inhibition (IC50), membrane permeability, cell cycle and the morphological features of apoptotic cells, respectively. Results: BBAE effectively inhibited the growth of 3T3-L1 preadipocytes in a dosage-dependent way, with an IC50 of approximately 214μg/mL. 3T3-L1 preadipocytes showed a significant (P＜0.05) lower LDH release (67.8%) after exposure to BBAE for 72 h than for 24h (89.0%) and 48 h (85.2%). No obvious improvement in the membrane permeability in 3T3-L1 preadipocytes was observed after BBAE treatment. BBAE effectively induced apoptosis of 3T3-L1 preadipocytes, significantly (P＜0.05) increased cell population in the sub-G1 phase, had no significant effect in the G2/M phase and exhibited a block in the S and G0/G1 phases. After incubation for 72 h in the presence of BBAE, 3T3-L1 preadipocytes exhibited typical apoptosis features observed under fluorescence microscope.

bog bilberry anthocyanin extract；3T3-L1 preadipocytes；growth inhibition；apoptosis

R282.71

A

1002-6630(2010)15-0248-05

2010-01-06

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目(2009-2-11)

柳嘉(1985—)，女，碩士，研究方向為營養(yǎng)與食品安全。E-mail：jessicaliujia@gmail.com

*通信作者：景浩(1957—)，男，教授，博士后，研究方向為營養(yǎng)與安全。E-mail：haojing@cau.edu.cn