金華鋒,萬 琪,吳 婷,史兆春

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江蘇南京,210029)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種以進行性認知功能障礙為特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。研究發(fā)現(xiàn),AD腦海馬新生神經(jīng)元的存活率顯著降低,新生神經(jīng)元的突起生長異常[1-2]。這表明,AD腦的神經(jīng)再生過程受到嚴重損害,提示神經(jīng)再生障礙可能是AD認知功能進行性減退的重要病理機制之一[3]。關(guān)于有氧訓(xùn)練引起AD大鼠認知功能改善進而影響海馬細胞存活的情況,國內(nèi)尚未見報道。為此,本研究通過觀察運動訓(xùn)練后AD大鼠學習記憶能力和海馬細胞存活的改變,初步探討AD后有氧訓(xùn)練對海馬神經(jīng)元功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級健康雄性SD大鼠(24月齡)24只,體重450±20 g,由中國人民解放軍軍事科學院實驗動物中心提供(合格證號:SCXK-(軍)-2008-004)。Aβ25-35、DAB 和 Triton X-100購自美國Sigma公司;Hoechst 33342購自美國Vector Laboratories。其他試劑均為分析純,購自南京化學試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:迷宮篩選非先天愚型SD大鼠24只。隨機分為假手術(shù)組(側(cè)腦室注射生理鹽水,n=8)、實驗組(側(cè)腦室注射Aβ25-35,n=8)、有氧訓(xùn)練組(側(cè)腦室注射Aβ25-35+四周有氧訓(xùn)練,n=8)。

1.2.2 老年癡呆大鼠模型制備:大鼠10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射進行麻醉,麻醉成功后將大鼠固定在立體定位儀(STOELTING)上,門齒固定插設(shè)在正中處,頭正中部去毛后皮膚消毒,頭頂正中切口,逐層切開皮膚、肌肉,于腦矢狀縫中部開口暴露顱蓋骨,參照Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜,于前囟后1.0 mm,向右旁開1.5 mm,硬腦膜下3.0 mm向雙側(cè)側(cè)腦室區(qū)緩慢注入 5 μ L(2 μ g/μ L,用無菌生理鹽水溶解Aβ25-35肽段完之后分裝,-20℃保存,用的時候取出一管37℃孵育7天),每側(cè)注射時間5 min,留針2 min,緩慢退針。所有操作均在無菌條件下進行,皮膚切開處用青霉素抗菌,縫合傷口。

1.2.3 有氧訓(xùn)練:Aβ25-35注射后第三天(此時Aβ的毒性最強)行有氧訓(xùn)練,采用無負重游泳,從實驗日起進行游泳訓(xùn)練,每次運動時間從最初的10 min/日,每天遞增10 min,直至達到60 min/日,并持續(xù)此量,共訓(xùn)練四周。水溫30±1℃,游泳訓(xùn)練池為180 cm×60 cm×80 cm,內(nèi)壁光滑。

根據(jù)嚙齒類動物的生活習慣,所有運動訓(xùn)練在晚上6點之后進行。

1.2.4 行為學測試:有氧訓(xùn)練結(jié)束后各組大鼠行Morris水迷宮(上海吉量軟件科技有限公司)檢測。Morris水迷宮為一圓形水池,直徑200 cm,高50 cm,水深30 cm,水溫控制在22～24℃。池壁表明四個入水點,由此將水池分為4個象限,任選某一象限(本實驗選擇第四象限),正中放置一個直徑11 cm、高29 cm的平臺。每天約同一時間(每晚七點)將大鼠按四個象限入水點依次放入水池中,記錄90 s內(nèi)大鼠從入水到找到平臺所用的時間,即逃避潛伏期(Escape Latency)。如90 s內(nèi)未能找到,引導(dǎo)其上平臺并停留10 s,本次成績記做90 s。Morris水迷宮測試一天一次,共訓(xùn)練5 d,實驗第6天撤去平臺,記錄大鼠穿越在原平臺位置的時間即空間探索實驗兩個部分。取4個象限測試成績的平均值為當日的學習成績。

1.2.5 Hoechst染色:細胞發(fā)生凋亡時,染色質(zhì)會固縮,熒光染料Hoechst 33342能少許進入正常細胞膜,使其染上低藍色,而凋亡細胞的膜通透性增強,因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的多,熒光強度要比正常細胞中要高,在熒光顯微鏡下觀察,正常細胞的細胞核呈正常的藍色,而凋亡細胞的細胞核會呈致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染,顏色有些發(fā)白。大鼠取腦、多聚甲醛固定方法同前。次日取出固定后的鼠腦,沿大腦縱裂切開成左右兩半并修飾腦片,行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋,做海馬連續(xù)冠狀石蠟切片(片厚4 μ m),每個動物連續(xù)切片計數(shù)5張取一張,取6張。將石蠟切片放入37℃烘箱過夜后,脫蠟水化,用PBS漂洗5 min,共洗3次后,吸盡液體。加入0.5 mL Hoechst 33342染色液,染色5 min。用PBS洗兩遍,每次3 min。將切片置于載玻片上,滴一滴抗淬滅封片液,蓋上一潔凈的蓋玻片,盡量避免氣泡。熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。最大激發(fā)波長為350 nm,最大發(fā)射波長為460 nm。Hoechst+細胞的計數(shù),按照單盲原則,計數(shù)前對所有免疫組化染色的腦片進行隨機編碼。在40×物鏡下,觀察每張腦片海馬亞顆粒細胞層(SGZ)及顆粒細胞層(GCL)內(nèi)的Hoechst+細胞數(shù),算出每張腦片SGZ和GCL區(qū)Hoechst+細胞數(shù)的平均值;用software Image J(NIH)測出每張腦片SGZ的長度,求得每張腦片SGZ的單位長度的Hoechst+細胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮測試結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較,實驗組的逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)。有氧訓(xùn)練組與實驗組相比,逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05);有氧訓(xùn)練組與正常對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

表1 各組水迷宮測試結(jié)果比較( ±s)

表1 各組水迷宮測試結(jié)果比較( ±s)

注:與假手術(shù)組比較,P<0.05;與實驗組比較,＊P<0.05

組別 n 逃避潛伏期(S)假手術(shù)組 8 18.1±5.9實驗組 8 25.5±18.4有氧訓(xùn)練組 8 15.5±5.3＊

2.2 各組大鼠海馬亞顆粒細胞層內(nèi)的Hoechst+細胞數(shù)比較

與假手術(shù)組比較,實驗組大鼠海馬區(qū)內(nèi)的Hoechst+細胞呈碎塊狀致密濃染,顏色有些發(fā)白,Hoechst+細胞數(shù)明顯增多(P<0.05);有氧訓(xùn)練組大鼠亞顆粒細胞層及顆粒細胞層內(nèi)的Hoechst+細胞呈致密濃染,陽性細胞數(shù)比實驗組明顯減少(P<0.05)。假手術(shù)組與有氧訓(xùn)練組大鼠海馬區(qū)內(nèi)的Hoechst+細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2、圖1、圖2。

表2 各組大鼠海馬區(qū)的Hoechst+細胞數(shù)比較( ±s)

表2 各組大鼠海馬區(qū)的Hoechst+細胞數(shù)比較( ±s)

注:與假手術(shù)組比較,P<0.05;與實驗組比較,＊P<0.05

組別 n 陽性細胞數(shù)(個/高倍視野)假手術(shù)組 8 5±1.7實驗組 8 15±3.9有氧訓(xùn)練組 8 7.4±2.2＊

圖1 各組大鼠海馬腦區(qū)內(nèi)的Hoechst染色比較

圖2 各組大鼠海馬腦區(qū)內(nèi)的Hoechst染色比較

3 討 論

AD是一種以獲得性持續(xù)性記憶減退、認知功能障礙以及行為異常為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。大量實驗驗證,Morris水迷宮作為檢測實驗動物學習記憶水平的重要工具,可以較好的評價認知功能。本實驗Morris水迷宮測試結(jié)果顯示實驗組較假手術(shù)組逃避潛伏期明顯延長,撤離平臺后在原平臺象限內(nèi)游泳的時間占整個游泳時間百分比顯著降低,表明實驗組大鼠學習記憶能力明顯下降。有氧訓(xùn)練組大鼠測試結(jié)果明顯好于實驗組,而與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。表明有氧訓(xùn)練可以顯著改善AD大鼠的認知功能,對AD大鼠空間認知功能損傷具有保護作用。研究發(fā)現(xiàn),AD腦海馬干細胞增殖有增加的趨勢,前體細胞的神經(jīng)元分化比例明顯減少,新生神經(jīng)元的存活率顯著降低,新生神經(jīng)元的突起生長異常。這些研究證實,AD腦的神經(jīng)再生過程受到嚴重損害,提示神經(jīng)再生障礙可能是AD認識功能進行性減退的重要病理機制之一。

AD基本的神經(jīng)病理學改變?yōu)?神經(jīng)元外形成大量的老年斑、神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)、區(qū)域性的神經(jīng)元及突觸丟失。目前研究認為β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)沉積是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié),Aβ的神經(jīng)毒性作用是導(dǎo)致AD發(fā)病的重要病因之一。Aβ是由淀粉樣前體蛋白剪切而來,Aβ25-35是具有Aβ神經(jīng)毒作用的最短片段。側(cè)腦室注射Aβ25-35能引起神經(jīng)元變性、突觸丟失、學習記憶能力受損等神經(jīng)系統(tǒng)退化的表現(xiàn),因此,Aβ25-35側(cè)腦室注射建立的AD模型與APP或APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠被廣泛地應(yīng)用于AD的研究[4-5]。

大量實驗證據(jù)已表明,高濃度的Aβ寡居體具有神經(jīng)毒性,導(dǎo)致神經(jīng)細胞的凋亡[6]。為本實驗結(jié)果顯示Aβ(25-35)短片段損害海馬區(qū)神經(jīng)細胞的存活。與假手術(shù)組相比,實驗組大鼠Hoechst陽性細胞增多,而經(jīng)過有氧訓(xùn)練后大鼠海馬各區(qū)域神經(jīng)元細胞凋亡明顯減少,這表明,Aβ?lián)p害細胞存活,有氧訓(xùn)練能阻止Aβ?lián)p害細胞存活。這一結(jié)果對于探求有氧運動改善AD認知功能障礙的病理生理機制,具有重要意義,同時在臨床上也有一定的應(yīng)用價值[7-8]。但本研究只是初步探討有氧運動與海馬神經(jīng)元細胞凋亡的關(guān)系,至于有氧運動影響海馬神經(jīng)元的細胞凋亡的機制及其相關(guān)的調(diào)控因子還有待于進一步的研究。

[1]Peng Y,Sun J,Hon S,et al.Nylander AN.L-3-n-butylphthalide improves cognitive impairment and reduces amyloid-beta in a transgenic model of Alzheimer's disease[J].J Neurosci,2010,30(24):8180.

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