郭紅陽,朱光澤,連樹林

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林長春130021)

產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌多重耐藥性與I類整合子的相關(guān)性研究

郭紅陽,朱光澤,連樹林

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林長春130021)

目的 了解來源于不同臨床標(biāo)本的肺炎克雷伯菌的耐藥性、攜帶第1類耐藥整合子的特征及基因盒的種類。方法 使用常規(guī)方法分離肺炎克雷伯菌;運(yùn)用法國梅里埃V ITEK細(xì)菌分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定;應(yīng)用PCR法擴(kuò)增第1類整合子;應(yīng)用紙片擴(kuò)散法對22種抗生素進(jìn)行耐藥性監(jiān)測和分析。結(jié)果 191株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌中檢測出I類整合子178株,檢出率為93.2%,I類整合子陽性菌對氨基糖苷類、喹諾酮類及頭孢菌素類藥物表現(xiàn)出較高的耐藥,其多重耐藥率明顯高于I類整合子陰性菌株。結(jié)論 I類整合子廣泛地存在產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌中,I類整合子對細(xì)菌多重耐藥性的產(chǎn)生和傳播起著重要作用。

肺炎克雷伯菌;ESBLs;整合子;多重耐藥

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1097)

本研究從基因水平入手檢測產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌的I類整合子,通過分析細(xì)菌的耐藥性,探討在整合子參與下,細(xì)菌間耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移與耐藥性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2005年至2008年臨床分離的419株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌。

1.2 儀器及試劑

Vitek-32型全自動微生物分析儀及 G NI+細(xì)菌鑒定卡均為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品;藥敏紙片均購自杭州天和微生物試制有限公司;亞胺培南購自法國生物梅里埃公司;M-H瓊脂為杭州天和微生物試劑公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù) I類整合酶序列[4]設(shè)計引物,KPintF:5-TGCGGGTTAAGG ATCTAG ATTT-3’; KPintR: 5-CAGCACATGCGTGTAG AT-3’,目的基因長度為 491 bp,由寶生物公司合成。

1.4 各樣品種克雷伯菌的分離鑒定

用法國生物梅里埃公司的Vitek-32型微生物分析儀、G NI+鑒定卡進(jìn)行菌株鑒定。

1.5 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株表型篩查和確證試驗

參照CLSI肺炎克雷伯、產(chǎn)酸克雷伯和大腸桿菌中ESBL s檢測的篩查和確證標(biāo)準(zhǔn),凡抑菌環(huán)頭孢噻肟或氨曲南≤27 mm、頭孢曲松≤25 mm、頭孢泊肟或頭孢他啶≤22 mm者為高度可疑株;同時使用頭孢噻肟和頭孢他啶,單獨(dú)和聯(lián)合克拉維酸復(fù)合制劑,任何一個藥物,在加克拉維酸后,抑菌環(huán)直徑與不加克拉維酸的抑菌環(huán)相比增大值≥5 mm,判斷為產(chǎn)ESBLs菌株。

1.6 PCR擴(kuò)增

采用改進(jìn)的酚/氯仿法抽提DNA模版,以O(shè)1群霍亂弧菌SK10作為I類整合子陽性對照菌,以純水為陰性對照。用引物 KPintF和 KPintR,反應(yīng)體系為:10×ExTaq Buffer,2.5μl;dNTP(10 mM),0.5μl;CAF/CAR,各 0.5μl;ExTaq酶,0.25μl;Template,1 μl;ddHσ2O,19.75μl;總體積,25μl。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min,然后進(jìn)入循環(huán),94℃變性30 s,56℃退火 30 s,72℃延伸 60 s,共 30個循環(huán),最后72℃延伸5 min,1%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.7 藥敏測定

采用紙片擴(kuò)散K-B法,依CLSI2006年標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 419份臨床標(biāo)本包括痰、腹水、尿、陰拭子、血液等,結(jié)果顯示從痰標(biāo)本中分離出的肺炎克雷伯菌最多312株占74.46%,其次是尿液36株占8.59%,具體分布情況見表1。419株肺炎克雷伯菌中產(chǎn)ESBLs菌株191株,占45.58%。

表1 419株肺炎克雷伯菌在臨床標(biāo)本中的分布

2.2 I類整合子基因檢測 對191株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌進(jìn)行 I類整合酶基因檢測,結(jié)果有178株菌擴(kuò)增出491 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物,和文獻(xiàn)報道intI1片段大小相符[5],確定為I類整合子陽性菌株,檢出率為93.2%。部分樣本電泳見圖1,其中6#為陽性對照,1#為陰性對照,其他4份標(biāo)本均為產(chǎn) ESBLs肺炎克雷伯菌。

圖1 I類整合子基因檢測PCR凝膠電泳圖

2.3 I類整合子陽性菌株與細(xì)菌耐藥的關(guān)系 對比I類整合子陽性菌株與陰性菌株對抗菌藥物的耐藥率,并做統(tǒng)計分析,結(jié)果見表2。除亞胺培南均敏感外,I類整合子陽性菌株對頭孢曲松、哌拉西林、丁胺卡那霉素和頭孢噻肟的耐藥率均在88%以上,其中氨芐西林的耐藥性達(dá)到100%,對頭孢他啶、環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲硝唑、四環(huán)素、左氧氟沙星、氨曲南、和頭孢噻肟的耐藥率也高于55%,而I類整合子陰性菌株對它們的耐藥率大多數(shù)都低于30%,有些甚至低于10%,如頭孢他啶、頭孢吡肟、妥布霉素等第3、4代頭孢菌素。

表2 I類整合子陽性及陰性產(chǎn)ESBLs克雷伯菌耐藥表型比較

3 討論

ESBLs是近年來國際上研究較為活躍一種重要的酶[5,6]。ESBLs大多數(shù)由 TEM-1,TEM-2及 SHV-1發(fā)生突變的衍生物,能水解青霉素類、頭孢菌素類及單酰胺類,能被克拉維酸等酶抑制劑所抑制,對頭霉素類及碳青霉烯類敏感。作者從419株臨床標(biāo)本分離的肺炎克雷伯菌中檢出191株產(chǎn)ESBLs KP,檢出率高達(dá)45.58%,與國內(nèi)文獻(xiàn)報道基本一致[7]?？梢婋S著近年來大量新廣譜抗生素,特別是第三代頭孢菌素的使用率增高,肺炎克雷伯菌的產(chǎn)ESBLs酶的比率呈現(xiàn)越來越高的趨勢,應(yīng)引起重視。

整合子介導(dǎo)的多重耐藥機(jī)制引起耐藥基因高效、快速轉(zhuǎn)移而備受重視。它作為一種可移動基因元件,通過整合酶的作用,捕獲外來的耐藥基因(包括對氨基糖苷類、喹喏酮類、磺胺和消毒劑等耐藥的基因)。整合子-基因盒系統(tǒng)是新的可移動基因元件,能捕獲和整合細(xì)菌的耐藥基因,是細(xì)菌多重耐藥形式和傳播的主要內(nèi)在機(jī)制[8-10],而抗菌藥物的選擇壓力是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性存在、發(fā)展的主要客觀因素,也向臨床治療多重耐藥菌株提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。JONES等[11]發(fā)現(xiàn)耐藥性可通過轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移給大腸埃希菌,說明整合子可由質(zhì)粒攜帶。杜艷等[12]研究認(rèn)為克雷伯菌的多重耐藥與I類整合子密切相關(guān)。表明I類整合子廣泛地存在產(chǎn) ESBLs肺炎克雷伯菌中,攜帶I類整合子的細(xì)菌更易表現(xiàn)出對氨基糖苷類、喹諾酮類及頭孢菌素類藥物的耐藥性。說明整合子對細(xì)菌耐藥性的播散確實有一定的作用,因此,整合子系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥機(jī)制越來越引起研究者們的關(guān)注,其中對多重耐藥性的研究有著非常重要的意義[13]。

從表2可以看出,產(chǎn) ESBLs菌株對抗生素的耐藥率大部分均高于不產(chǎn)ESBLs菌株,并且與喹諾酮類、氨基糖苷類等多種抗生素存在交叉耐藥。這是由于ESBLs的耐藥基因常由可結(jié)合性大質(zhì)粒編碼,可攜帶對喹諾酮類、氨基糖苷類等多種抗生素的耐藥基因形成具有多種耐藥表型的泛耐藥菌[14]。樣品中產(chǎn)ESBLs株耐藥率極高,除對亞胺培南和頭孢西丁外幾乎對其他所有抗菌藥物均耐藥,哌拉西林/他唑巴坦具有很強(qiáng)的抗菌作用,本組耐藥率為43.3%,可能是由于他唑巴坦對 ESBLs酶有滅活作用,在與哌拉西林聯(lián)用時,增強(qiáng)了哌拉西林的作用[15]。

頭孢菌素中以頭孢吡肟抗菌作用最強(qiáng),原因可能是因為第4代頭孢菌素對β-內(nèi)酰胺酶親和力較低,應(yīng)用時間較短,且能快速地通過細(xì)菌的外膜屏障與PBP結(jié)合而發(fā)揮較強(qiáng)的抗菌作用[16],本組耐藥率為44.3%;頭霉類抗生素對肺炎克雷伯菌的抗菌活性優(yōu)于第一、二代頭孢菌素和多數(shù)三代頭孢菌素,本組頭孢西丁耐藥率為2.9%,這可能與其含有對ESBLs酶相對穩(wěn)定的7-α甲基側(cè)鏈有關(guān)[17]。亞胺培南仍是所有被測藥物中對肺炎克雷伯菌抗菌作用最強(qiáng)的抗生素,本組191份菌株對亞胺培南均敏感?？梢妼Ξa(chǎn)酶肺炎克雷伯菌的臨床經(jīng)驗性用藥一般首選碳青霉烯類,其次是β-內(nèi)酰酶類抗生素和酶抑制劑、頭霉類抗生素及其他敏感抗生素。

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ESBLs producing K lebsiella pneumoniae strains with class I integron Correlation

GUO Hong-yang,ZHU Guang-ze,LIAN Shu-lin.
(The Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun130021,China)

Objective T o understand the resistance and the characteristic of class 1 integron carried by K.pneumoniae from different samples,and elucidate the statusof gene cassettes.Methods Routine method was used to isolate K.pneumoniae;identified by V ITEK;Antibiotic suscep tibilitywas tested with the K-B diffusion method;Class 1 integrons were detected by PCR.Results ClassⅠintegron gene was found in 93.2%of 178 strains of ESBLs-producing K lebsiella pneum onia.The positive strains of classI integrons showed higher multidrug resistance to aminoglycosides and/or fluoroquinolones and/or cephalosporins than the negative strains of classI integrons.Conclusion ClassI integrons were p revalent in ESBLs-producing K lebsiella pneum onia and played an important role in the development and dissemination ofmultidrug resistance.

K lebsiella pneum onia;ESBLs;Integrons;Multidrug resistant

R378.99+6< class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

A

1007-4287(2010)07-1097-03

2008-10-13)