王 琳，朱 纓

(蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215009)

葉下珠 Phyllanthus urinaria L.為大戟科葉下珠屬植物葉下珠的干燥全草，又名珍珠草、夜合草、陰陽(yáng)草，主要分布于長(zhǎng)江流域和南方諸省[1]。該藥具有清熱、解毒、明目等功效，是一種傳統(tǒng)的中草藥。葉下珠具有明顯的抗乙型肝炎病毒(HBV)、保護(hù)肝損傷等藥理作用，是一種尚未開發(fā)利用但很有價(jià)值的藥用資源，黃酮為其抗病毒有效成分之一[2]。筆者以槲皮素作為葉下珠中黃酮類成分的代表，采用高效液相色譜法測(cè)定不同生長(zhǎng)期葉下珠中槲皮素的含量，為正確選擇葉下珠藥材的采收期提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(包括G1311A型四元泵，G1315B型DAD檢測(cè)器，G1322型在線脫氣機(jī)，7725i型手動(dòng)進(jìn)樣器);Agilent HPLC系統(tǒng)化學(xué)工作站;CP225D型Sartorius電子天平。槲皮素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100081-200406);葉下珠藥材是本課題組成員在本院藥用植物園中種植的，經(jīng)本院朱纓副教授鑒定均為大戟科葉下珠屬植物葉下珠 Phyllanthus urinaria L.;乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Zorbax SB-C18柱(250 mm ×4.6 mm，5.0 μm);流動(dòng)相:乙腈 -0.2%磷酸(30 ∶70);進(jìn)樣量:20 μL;流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):370 nm;柱溫:30℃。在此色譜條件下，葉下珠中槲皮素達(dá)到基線分離，且其他組分色譜峰不干擾測(cè)定(圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱定干燥至恒重的槲皮素對(duì)照品5.0 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.05 g/L的槲皮素對(duì)照品溶液。取葉下珠粗粉約15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇147 mL，再精密加入濃鹽酸3 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液5 mL置10 mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密吸取對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL，置 10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系列對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，以槲皮素峰面積值(Y)與含量(X)進(jìn)行回歸，得回歸方程 Y=823.78X+1.974，r=0.9999(n=6)。結(jié)果表明，槲皮素進(jìn)樣量在 0.05 ～0.40 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為0.012 g/L的槲皮素對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積平均值為195.2，RSD為2.14%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):分別取2008年9月采收的葉下珠藥材粗粉6份，按溶液制備方法操作，制備6份供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果峰面積平均值為106.5，平均含量0.127 mg/g，RSD為1.2%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取2008年9月采收的葉下珠藥材，按溶液制備方法操作，制備 1 份供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，10 h 時(shí)測(cè)定峰面積。結(jié)果峰面積平均值為104.7，RSD為2.42%(n=6)，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量(0.127 mg/g)的葉下珠粉末6份，每份約7.5 g，精密稱定，分別加入質(zhì)量濃度為0.954 g/L的槲皮素對(duì)照品溶液1 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果見表1。

表1 槲皮素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

將2009年6月至10月采收的葉下珠藥材按上述方法制備供試品溶液，取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20 μL，測(cè)定葉下珠中的槲皮素含量。結(jié)果見表2。

表2 葉下珠中槲皮素含量測(cè)定結(jié)果(n=5)

3 討論

曾分別采用100%甲醇+濃酸，75%甲醇+濃酸，50%甲醇+濃酸回流提取和超聲波法提取[3]，結(jié)果第1種方法和第4種方法中槲皮素提取率低，第3種方法雜質(zhì)較多、難分離，只有第2種方法中槲皮素提取率高且易于分離。

為了找到最合適的檢測(cè)波長(zhǎng)，曾用DAD檢測(cè)器對(duì)槲皮素對(duì)照品溶液進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，通過分析掃描圖發(fā)現(xiàn)，在370 nm波長(zhǎng)處，槲皮素吸收峰的峰形較好，吸光度較大，故選擇370 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，吸光度最低的285 nm作為參比波長(zhǎng)。

試驗(yàn)中曾選用甲醇-0.4%磷酸[4]、甲醇-乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇會(huì)使槲皮素形成前沿峰，影響檢測(cè)結(jié)果，故選擇了最后一種流動(dòng)相條件。在流動(dòng)相中加入一定量的磷酸是為了改善峰形和分離度，但為了增加柱的穩(wěn)定性和使用壽命，應(yīng)在保證分離度的情況下將磷酸的用量控制在最低。

葉下珠藥材中槲皮素含量隨著生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)而不斷增高，在地上部分枯萎前含量最高。因此，葉下珠的最佳采收期應(yīng)為9月至10月。

[1]吳克芹，吳克霞，李俊婕.抗乙肝植物藥葉下珠的研究進(jìn)展[J].齊魯藥事，2008，27(10):612.

[2]賀浪沖，岐 林，呂居?jì)梗?陜西葉下珠藥用開發(fā)研究Ⅲ:葉下珠提取物體外滅活HBV抗原作用[J].西北藥學(xué)雜志，1996，11(1):11.

[3]王樹松，劉風(fēng)云.不同生長(zhǎng)期柿葉總黃酮和槲皮素的含量測(cè)定[J].中國(guó)藥業(yè)，2007，16(9):22.

[4]繆亞東，歐陽(yáng)臻，袁 斌.高效液相色譜法測(cè)定野馬追藥材中槲皮素和山柰素含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2008，18(10):20.