陳 霞，尹曉娟

(1.中國人民解放軍第324醫(yī)院兒科，重慶 400020; 2.中國人民解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院八一兒童醫(yī)院，北京 100700)

間充質(zhì)干細胞是臨床研究最常用的細胞來源，在組織工程研究、創(chuàng)傷修復、疾病終末期治療等領域應用廣泛，種子細胞的來源已成為國內(nèi)外學者探討的熱點。胎盤作為胚胎發(fā)育過程中維系母體和胎兒氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)交換的重要暫時性器官，主要由起源于細胞滋養(yǎng)層和胚外中胚層的胎兒叢密絨毛膜和母體子宮基蛻膜共同組成，被視為產(chǎn)后“廢棄物”，因而具有最佳的倫理學優(yōu)勢和應用前景。筆者主要對胎盤來源的間充質(zhì)干細胞的生物學特性和向神經(jīng)前體細胞分化的特點進行研究，并用菲立磁標記成功，期望下一步研究能將胎盤間充質(zhì)干細胞用于新生兒缺血缺氧性腦病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);CO2培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱(法國Jouan公司);流式細胞儀(美國Beckman-Coulter公司);6孔、24孔培養(yǎng)板(美國Corning公司);菲立磁(美國先進磁力公司)。低糖DMEM培養(yǎng)基(DMEM-LG，美國Gibco公司);胎牛血清(美國Hyclone公司);重組人堿性成纖維生長因子(bFGF)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，表皮生長因子(EGF)均為美國R＆D公司產(chǎn)品;淋巴細胞分離液(Ficoll，密度1.077 g/mL，上海試劑二廠);鼠抗人 CD14，CD34，CD105，CD73，單克隆抗體和Ⅳ型膠原酶，多聚左旋賴氨酸(PLL)均為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 胎盤間充質(zhì)干細胞的分離

取足月剖宮產(chǎn)胎兒的胎盤(根據(jù)醫(yī)院規(guī)定并經(jīng)家屬同意)，剝離母體蛻膜面和胎兒面羊膜，取小塊胎兒的胎盤組織100 g，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3～5遍，剪成碎片，加入0.1%Ⅳ型膠原酶，37℃下消化60 min，見組織液渾濁后用4層紗布過濾。過濾后的懸液用胎牛血清中和，1 200 r/min離心10 min后，再以500 r/min離心5 min。去除上清液，加入完全培養(yǎng)基[含低糖DMEM，10%胎牛血清(FBS)，100 U/mL青、鏈霉素]，置37℃及5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3～4 d進行換液，待細胞90%鋪滿培養(yǎng)瓶底時，用0.25%胰蛋白酶消化，3～5 d傳代1次。

1.2.2 間充質(zhì)干細胞的表面分子鑒定

將長滿90%的細胞去掉培養(yǎng)液后，加入2.5 g/L胰酶消化，形成的細胞懸液以1 000 r/min離心5 min，去除上清液，加入全培養(yǎng)基 2 mL重懸細胞，調(diào)整細胞密度為 4×105個/mL。加入 CD34，CD45，CD73，CD105一抗，室溫、避光反應 1 h，上流式細胞儀檢測。

1.2.3 間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)前體細胞分化

制作細胞爬片，加入6孔板中，取第3代胎盤來源的間充質(zhì)干細胞種于爬片上，以DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞長至鋪滿70% ～80%玻片時，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍，換10 ng/mL EGF+10 ng/mL bFGF+DMEM/F12，并分別添加相應濃度的血清，預誘導3 d后，吸去培養(yǎng)液，洗凈后加入DMEM/F12+0.1 μmol/L全反式維甲酸(RA)、10 ng/mL GDNF+10 ng/mL BDNF進行正式誘導，并添加相應濃度的血清，每6～8 h于倒置顯微鏡下觀察細胞。

1.2.4 Feridex標記神經(jīng)前體細胞

用含15%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液稀釋Feridex至25mg/L，加入PLL(最終質(zhì)量濃度為0.75 mg/L)37℃孵育1 h。將分化的神經(jīng)前體細胞調(diào)整細胞密度為2×106/mL，移入細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，12 h后提取細胞離心，細胞沉淀用PBS洗滌3次，更換無鐵的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d，細胞提取行普魯士藍染色鑒定所分化細胞及常規(guī)ABC法進行抗Nestin免疫組織化學染色，DAB-H2O2棕色法呈色，顯微鏡下觀察結果。

2 結果

初接種的細胞種類較多，大部分呈圓形。接種24 h后可見部分圓形單核細胞貼壁。原代培養(yǎng)36～48 h后貼壁的單核細胞開始增多，但仍保留圓形。72 h后細胞開始增殖迅速并出現(xiàn)多種形態(tài)。大多數(shù)細胞呈梭形并帶有2～3個長的突起;細胞核較大，扁圓形，可見1～2個核仁。少部分細胞呈不規(guī)則形，形態(tài)多樣，胞體大;胞核為圓形或橢圓形，有多個核仁;胞漿可向不同方向伸出突起;細胞集落間相互融合成單層，排列具有一定方向性。細胞倍增時間7～10 d。反復換液和傳代培養(yǎng)去除非貼壁細胞，至第3代的PMSCs形態(tài)基本單一，為梭形或扁平形，增殖至細胞融合時，倒置相差顯微鏡下觀察呈漩渦狀排列(圖1)。流式細胞儀鑒定表面分子標志見圖2。PMSCs經(jīng)誘導3 d后可見轉(zhuǎn)化的細胞增殖分裂成小圓形，呈團簇狀半懸浮狀態(tài)。對這些細胞進行連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)其胞體逐漸增大，并有突起逐漸伸出、延長，誘導7 d后可見大量具有2個或多個突起的細胞，胞體呈大多角形或不規(guī)則形，類似于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞形態(tài)，折光性較強，細胞突起間相互連接成網(wǎng)狀，具有典型的神經(jīng)元細胞樣形態(tài)。Feridex標記分化的神經(jīng)干細胞見圖3。

圖1 PMSCs培養(yǎng)至3代，細胞呈漩渦狀排列40×1

圖2 流式細胞儀鑒定表面分子標志圖

3 討論

圖3 Feridex標記分化的神經(jīng)干細胞圖

人類的胎盤在胚胎發(fā)育、營養(yǎng)、免疫耐受過程中不僅扮演了基礎和重要的角色，而且含有大量的祖/干細胞[1]。一個成熟的胎盤直徑15～20 cm，厚度2～3 cm，一般分為羊膜上皮、羊膜間質(zhì)、絨毛滋養(yǎng)層、絨毛間質(zhì)4個部分，從這些部分可以分離人羊膜上皮細胞、人羊膜間充質(zhì)干細胞、人絨毛間充質(zhì)干細胞、人絨毛滋養(yǎng)層細胞[2]。研究表明，人羊膜和絨毛間充質(zhì)干細胞具有自我更新能力，呈成纖維細胞樣克隆生長，表達特殊的表面抗原，具有多向分化能力以及為胚胎來源[3-4]。國外報道，將胎盤來源的間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，取得了良好效果[5-6]。它與骨髓來源的間充質(zhì)干細胞比較具有以下優(yōu)點:在來源方面，胎盤是產(chǎn)后“廢棄”組織，來源廣泛、取材方便，且滿足倫理學要求。成體組織如骨髓、脂肪組織、外周血都必須通過穿刺獲得，不僅對供者造成創(chuàng)傷，還會增加受污染的概率，同時也無法大量獲取。骨髓組織中間充質(zhì)干細胞的含量極低，這也是骨髓來源的間充質(zhì)干細胞的一個缺點，而且供者年齡在一定程度上也限制了骨髓來源的間充質(zhì)干細胞的進一步應用，而胎盤作為產(chǎn)后組織則可避免年齡的影響。此外，胎盤組織如臍帶和臍帶血可以低溫保存，可用于建立細胞庫，而骨髓卻很難實現(xiàn)[7]。

本研究應用膠原酶消化法從胎盤中獲得了呈成纖維樣漩渦樣生長的細胞，間充質(zhì)干細胞的標志物表達陽性(CD105，CD73)，間充質(zhì)干細胞標志物表達陰性(CD34，CD14)。用10 ng/mL EGF+10 ng/mL bFGF+DMEM/F12預誘導后，改為 DMEM/F12+0.1 μmol/L RA，10 ng/mL GDNF+10 ng/mL BDNF正式誘導，7 d后細胞分化成類似于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞形態(tài)。將終質(zhì)量濃度為0.75 mg/L的Feridex標記分化的細胞，普魯士藍顯示90%以上的干細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)細小的藍色鐵顆粒，倒差顯微鏡下觀察顯示nestin陽性，證實誘導分化成功。本研究成功地將胎盤來源的間充質(zhì)干細胞誘導分化為神經(jīng)干細胞，希望在下一步的研究中能應用于兒童不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)疾病如缺血缺氧性腦病。

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