劉淑英 儲 平 楊 鐸 張玉平

濟寧市第一人民醫(yī)院（272111）

卵巢癌是婦產科常見腫瘤之一，由于起病隱匿，難以早期發(fā)現(xiàn)、早期治療，因而成為婦產科病死率最高的惡性腫瘤[1,2]，嚴重威脅著患者的生命。有研究證實，卵巢癌患者血清、腹水中IL-6、IL-8、TNF-α等細胞因子的表達異常升高[3]，但卵巢癌組織中上述因子的表達情況及其在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制尚不明確。為此，我們采用熒光定量PCR的方法檢測了正常卵巢組織及卵巢癌組織中IL-6、IL-8、TNF-α等mRNA的表達水平，以期通過分析細胞因子轉錄水平的改變，探討卵巢癌的內在發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇山東省濟寧市第一人民醫(yī)院2004年5月至2008年11月收治的原發(fā)卵巢癌患者68例為實驗組，年齡32～72歲，平均62歲，術前均未接受放化療治療。正常對照組卵巢組織取自同期60例子宮肌瘤行全子宮加一側或雙附件切除患者，年齡39～59歲，平均年齡55歲。兩組患者年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），所有診斷均經(jīng)病理檢查證實。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本收集

術中切取標本，用無菌生理鹽水沖凈血液后迅速置于液氮中冷凍，然后轉入- 80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計與合成

根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫提供的IL-6、IL-8、TNF-α基因以及內參β-Actin（ACTB）基因序列，設計跨外顯子引物，并采用Blast在線對所設計的引物進行特異性的比對（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），引物序列見表1。所有引物均由上海博尚公司合成。

1.2.3 組織總RNA的提取及cDNA的合成

將凍存的組織在液氮中研磨，加入Trizol（Invitrogen公司）充分裂解細胞，按照說明書提取總RNA，經(jīng)過酚和氯仿抽提后溶解到DEPC處理的水中。瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外線分光光度計測定吸光度值以確定RNA 濃度和純度。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列

1.2.4 cDNA合成

反應體系（20μL）含RNA 2μg、Oligo （dT）1μL、M-MLV逆轉錄酶 （200U/μL） 1μL、dN TP （10mmol/L）1μL、5×緩沖液4μL及DEPC處理三蒸水。反應條件為42 ℃延伸60min合成cDNA，95℃ 5min 滅活M-MLV逆轉錄酶，4℃冷卻5min，置于- 20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 實時熒光定量PCR

應用ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行半定量檢測，反應體系（25μL）含：第一鏈cDNA 1μL，2×SYBR Green Mix （Takara公

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS11.0和Excel統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。相對表達率以±s表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異，P＜0.01為統(tǒng)計學差異顯著。

2 結 果

2.1 PCR擴增特異性

圖1 各基因擴增產物的溶解曲線

IL-6、IL-8、TNF-α以及內參基因ACTB擴增產物的溶解曲線均呈現(xiàn)單一峰（圖1）；瓊脂糖電泳結果均顯示為單一條帶，其片段大小與預先設計的產物大小一致，沒有非特異性擴增和引物二聚體的存在。上述結果說明實時熒光定量PCR擴增反應體系具有很好的特異性。司）12.5μL，5μmol/L上下游引物各1μL，三蒸水9.5μL。反應條件為95℃ 5s、95℃ 15s、60℃ 15s、72℃ 35s（收集熒光），40個循環(huán)。經(jīng)溶解曲線和2%瓊脂糖電泳，判斷擴增產物特異性。溶解曲線反應條件：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，6o℃ 15s，速度為1.6℃/s。

1.2.6 計算相對表達率

內參基因表達穩(wěn)定，受實驗因素影響小，因而可通過目的基因相對于內參基因ACTB的表達比來表示不同目的基因的表達變化。相對定量分析（2△△CT）公式為：Ratio=2△CT目的（對照一樣本）／2△CT內參（對照一樣本）。

2.2 IL-6、IL-8、TNF-α在正常和卵巢癌組織中的表達

IL-6、IL-8、TNF-α在所有檢測標本中均存在表達，其相對于內參基因ACTB的相對表達比見圖2。

分析結果顯示，卵巢癌組織中IL-6和IL-8的表達明顯高于正常對照組織，分別達到正常組織表達量的（8.78±1.32）和（11.41±1.65）倍，統(tǒng)計學差異非常顯著（P＜0.01）；與其相比，腫瘤組織中TNF-α的表達差異較小，為正常對照組織的（2.19±1.02）倍，但仍具有明顯的統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見表2。

表2 IL-6、IL-8、TNF-α在正常和卵巢癌組織中的表達

圖2 IL-6、IL-8、TNF-α在正常和卵巢癌組織中的表達

3 討 論

卵巢癌是婦科病死率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病機制的研究受到了越來越多的重視[4]。近年來，有關于卵巢癌細胞因子的研究取得了可喜的進展，研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者外周血多種細胞因子的表達水平出現(xiàn)明顯的異常[5,6]，這說明細胞因子的表達與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展存在著密切的關系。但值得注意的是，外周血細胞因子的表達水平受到機體和外來多種因素的影響，因而不能直接反映腫瘤局部的變化情況。那么卵巢癌腫瘤組織中細胞因子的表達是否也存在著相應的變化呢？這種改變是否發(fā)生于細胞因子的轉錄水平呢？為了解決上述問題，我們采用實時熒光定量PCR的方法檢測了卵巢癌組織中IL-6、IL-8、TNF-α等細胞因子mRNA的表達，并與正常卵巢組織對比，分析了上述細胞因子的表達變化與卵巢癌發(fā)病之間的關系。

目前實時熒光定量PCR技術不但實現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，而且具有高度的敏感性、準確性以及較好的可重復性，目前已逐漸成為檢測低豐度mRNA表達的最敏感準確的方法。

IL-6主要來自于單核-巨噬細胞、淋巴細胞以及成纖維細胞的合成分泌，在機體免疫應答過程中發(fā)揮著重要的作用[7]。近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞也可分泌IL-6。我們的檢測結果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中IL-6 mRNA表達明顯高于正常組織，兩組比較有顯著性差異，這說明卵巢癌發(fā)病過程中，腫瘤細胞和浸潤淋巴細胞合成IL-6水平明顯增加。Nilsson等[8]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的卵巢癌細胞培養(yǎng)上清中IL-6的活性明顯增強，并可進一步刺激腫瘤細胞的增殖、減少癌細胞之間的黏附作用、促進新生血管的生成，進而促進腫瘤的轉移和浸潤，因此腫瘤細胞分泌IL-6對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起到了重要的作用。另一方面，腫瘤局部高表達的IL-6，作為一種免疫抑制因子，可通過旁分泌作用抑制浸潤淋巴細胞、單核細胞的腫瘤細胞的增殖和殺傷作用，從而達到使腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視、免疫殺傷的作用。

IL-8是一種多功能趨化因子和促血管生長因子，可促進腫瘤的生長、新生血管的生成，并通過影響細胞的黏附促進腫瘤細胞的轉移[9]。我們的檢測結果顯示，與IL-6相類似，卵巢癌組織中IL-8的表達水平也明顯高于正常卵巢組織。

TNF-α是單核-巨噬細胞產生的一種多功能細胞因子，參與多項免疫應答的調節(jié)。我們的實驗結果證實卵巢癌組織中TNF-α的轉錄水平高于正常卵巢組織。有研究認為，腫瘤細胞合成的TNF-α可通過自分泌和旁分泌作用刺激腫瘤細胞自身的增殖，但也有學者的觀點恰好相反，認為TNF-α可誘導腫瘤出血、壞死，從而達到抑制腫瘤生長的作用，甚至有望成為治療腫瘤的生物制劑[10]。

卵巢癌細胞合成、分泌的細胞因子通過自分泌、旁分泌等作用可誘導腫瘤組織中浸潤的單核細胞、淋巴細胞等釋放的細胞因子發(fā)生改變，形成級聯(lián)放大作用，甚至影響到外周血、腹水中細胞因子的水平，從而達到臨床檢測的目的。

需要注意的是，機體的細胞因子形成一個復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)，相互協(xié)調、相互制約，任何一種細胞因子的改變都不可能是孤立的，而且在不同的生理和病理條件下往往發(fā)揮不同的免疫學作用。因此，腫瘤環(huán)境下細胞因子的變化需要綜合分析，才能有助于探討腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

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