王 珍， 李 矗

(1.安徽省藥品審評(píng)認(rèn)證中心，安徽合肥230022;2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院，安徽合肥230001)

補(bǔ)腎健脾顆粒是根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)方開發(fā)的中藥復(fù)方制劑，由骨碎補(bǔ)、川牛膝、獨(dú)活等中藥組成，具有補(bǔ)腎健脾，活血散寒之功，用于治療骨性關(guān)節(jié)炎證見脾腎兩虛、寒濕瘀阻證。本文采用薄層色譜法對(duì)其中的骨碎補(bǔ)、川牛膝、獨(dú)活、黨參、當(dāng)歸進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法對(duì)骨碎補(bǔ)中的有效成分柚皮苷進(jìn)行含量測(cè)定，可有效控制補(bǔ)腎健脾顆粒的質(zhì)量。

1 儀器、試藥與樣品

島津LC-10AT型高效液相色譜儀(單元泵，紫外檢測(cè)器，浙大N2000色譜工作站);天津奧特塞斯AT-130型柱溫箱;UV-1700型紫外分光光度計(jì)(島津);超聲波清洗器HS3120型。柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)110722-200307，供含量測(cè)定用)，川牛膝對(duì)照藥材(批號(hào)121066-200203);獨(dú)活對(duì)照藥材(批號(hào) 130940-200205)，黨參對(duì)照藥材(批號(hào) 121057-200303)，黨參炔苷對(duì)照品(111732-200804)，阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)110773-9910)，均購于中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈、磷酸為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為化學(xué)純。補(bǔ)腎健脾顆粒由安徽九鼎醫(yī)藥科技有限公司提供(規(guī)格:每袋裝10 g)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 骨碎補(bǔ)的鑒別［1］取本品3 g，加水50 mL攪拌，微熱使溶解，用乙醚萃取2次，每次30 mL，棄去乙醚液，再用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取柚皮苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下分層的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾。見圖1。

圖1 骨碎補(bǔ)鑒別薄層色譜圖

2.1.2 川牛膝的鑒別［2］取本品研細(xì)，取細(xì)粉5 g，加75%乙醇50 mL，加熱回流提取1 h，濾過，濾液水浴蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，水溶液用乙醚10 mL振搖提取，提取液揮干乙醚，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取川牛膝對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-三氯甲烷-丙酮(8∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾。見圖2。

2.1.3 獨(dú)活的鑒別［3］取本品3 g，加水50 mL攪拌，微熱使溶解，用乙醚萃取2次，每次30 mL，合并乙醚液，低溫(30℃)揮干乙醚，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取獨(dú)活對(duì)照藥材0.6 g，加乙醚10 mL，超聲處理5 min，濾過，濾液作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各7μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(8∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾。見圖3。

圖2 川牛膝鑒別薄層色譜圖

圖3 獨(dú)活鑒別薄層色譜圖

2.1.4 黨參的鑒別［4］取本品10 g，研細(xì)，加甲醇100 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的氨試液洗滌2次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，通過D101型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5 cm，柱高10 cm)，用水50 mL洗脫，棄去水液，再用50%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取黨參對(duì)照藥材1 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，自“殘?jiān)铀?0 mL使溶解”起，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取黨參炔苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液與對(duì)照藥材溶液各5μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾。見圖4。

2.1.5 當(dāng)歸的鑒別 取本品10 g，加1%碳酸氫鈉溶液100 mL，攪拌10 min，靜置，取上清液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取阿魏酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無干擾。見圖5。

圖4 黨參鑒別薄層色譜圖

圖5 當(dāng)歸鑒別薄層色譜圖

2.2 柚皮苷的含量測(cè)定

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，骨碎補(bǔ)能改變軟骨細(xì)胞功能，推遲細(xì)胞退行性變，降低骨關(guān)節(jié)病的發(fā)病率及發(fā)病程度，推遲發(fā)病時(shí)間［5］，為本方中的君藥。參考中國(guó)藥典2005年版一部中骨碎補(bǔ)和枳殼［6］項(xiàng)下柚皮苷的含量測(cè)定方法，并結(jié)合本劑型特點(diǎn)，研究建立HPLC法測(cè)定本方中柚皮苷含量，進(jìn)行方法學(xué)考察，該方法分離度良好，簡(jiǎn)單、靈敏、可靠。

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱:Waters C18(250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸溶液(19.5∶80.5);檢測(cè)波長(zhǎng):283 nm;柱溫:25℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20μL;理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取減壓干燥至恒重的柚皮苷對(duì)照品10 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含柚皮苷40μg)。

2.2.3 供試品溶液制備 取本品研細(xì)，取細(xì)粉2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，密塞，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性溶液制備 取按處方量制備的缺骨碎補(bǔ)的空白樣品，照供試品溶液的制備方法制備。

2.2.5 陰性干擾試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各20μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果陰性溶液在與對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間處無峰出現(xiàn)，可見本品中其它成分對(duì)柚皮苷的測(cè)定無干擾。見圖6。

圖6 對(duì)照品、樣品、陰性樣品HPLC色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密量取濃度為0.039 mg/mL和0.195 mg/mL的柚皮苷對(duì)照品溶液各5、10、15μL，按前述色譜條件注入液相色譜儀，計(jì)錄峰面積。以柚皮苷濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算，得回歸方程為:Y=708 793X－7 700.8，r=0.999 9。表明柚皮苷在0.195～2.925μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 供試品精密度試驗(yàn) 取按供試品溶液制備法制備的供試液(批號(hào)040402)，按上述色譜條件注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄柚皮苷峰面積分別為479 284、485 766、478 891、483 806、471 237、481 021，RSD=1.05%，表明精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將按供試品溶液制備法制備的供試液(批號(hào)040402)于 0，1，2，4，6，8 h 按上述色譜條件重復(fù)測(cè)定1次，記錄柚皮苷峰面積分別為482 004、491 344、489 396、483 830、497 579、476 929，RSD=1.52%。表明供試液在 8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(批號(hào)040402)共6份，按供試品溶液制備法制備供試液，精密量取該溶液和對(duì)照品溶液各20μL，按上述色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算柚皮苷含量分別為 0.84，0.86，0.86，0.84，0.85，0.85 mg/g，RSD=1.05%。表明方法重復(fù)性良好。

2.2.10 回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量(0.85 mg/g)的同一批號(hào)的樣品(批號(hào)040402)1 g共6份，再分別精密加入0.284 mg/mL柚皮苷對(duì)照品甲醇液3 mL，混合均勻，水浴蒸干，以下按供試品溶液的制備方法配制成供試液。分別取該溶液和對(duì)照品溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算柚皮苷含量，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.11 樣品測(cè)定 對(duì)3批小試樣品(批號(hào)分別為040401，040402，040501)和 3批中試樣品(批號(hào)分別為 060601，060602，060603)按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別精密吸取樣品溶液和對(duì)照品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 本品為中藥復(fù)方制劑，采用薄層色譜鑒別方法對(duì)方中的主要藥味均進(jìn)行了鑒別，并進(jìn)行了陰性對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果其方法簡(jiǎn)便且專屬性強(qiáng)，可有效控制本品的質(zhì)量。其中川牛膝的薄層色譜鑒別在2005年中國(guó)藥典一部中未收載，文獻(xiàn)中報(bào)道亦較少，大多采用顯微鑒別和理化鑒別，其專屬性較差，本文采用的方法具有很強(qiáng)的專屬性，可為川牛膝藥材和含川牛膝制劑的色譜鑒別提供參考。

3.2 骨碎補(bǔ)中柚皮苷的含量測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道較多，但在本制劑中尚未見報(bào)道。我們參考藥典骨碎補(bǔ)藥材項(xiàng)下含量測(cè)定項(xiàng)，流動(dòng)相為甲醇-醋酸-水(35∶4∶65)進(jìn)行操作，結(jié)果柚皮苷出峰時(shí)間過長(zhǎng)，達(dá)28 min，且塔板數(shù)較低，約為5 000;參考藥典枳殼藥材項(xiàng)下流動(dòng)相:乙腈-水(21.5∶80.5)，用磷酸調(diào)節(jié)至pH3，柚皮苷塔板數(shù)達(dá)9 000，調(diào)節(jié)乙腈與水的比例，結(jié)果得到了較好的出峰時(shí)間(16 min)。

3.3 曾對(duì)含量測(cè)定中供試品溶液提取方法進(jìn)行了考察，藥典是采用甲醇回流提取3h，考慮到本品骨碎補(bǔ)藥材投料時(shí)采用醇提工藝，所以進(jìn)行了不同時(shí)間的回流和超聲處理比較試驗(yàn)。結(jié)果表明采用文中的方法即甲醇超聲30 min，功率120 W，頻率40 kHz為佳。

［1］何夏秋，賀建華，馬燕瓊，等.用薄層法鑒別與測(cè)定千金救心膠囊中柚皮苷的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2003，9(4):10-12.

［2］杜志謙，江海肖，夏華玲，等.筋骨痛消丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2002，8(4):13-15.

［3］苗明三，李振國(guó)主編.現(xiàn)代實(shí)用中藥質(zhì)量控制技術(shù)［M］.第一版，北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:778，825.

［4］中國(guó)藥典［S］.一部.2010:264.

［5］趙湘洪，陳寶興，丁繼華，等.骨碎補(bǔ)對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨性關(guān)節(jié)炎的治療作用［J］.中國(guó)中藥雜志，1987，12(10):41.

［6］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:180，171.