刁海鵬， 杜 艷， 丁 紅， 孫體健

(山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原030001)

水蔓菁為玄參科細(xì)葉婆婆納屬水蔓菁(Veronica linariifolia)，具有清熱解毒、利尿、止咳化痰等作用［1］。主要化學(xué)成分為芹黃素、木犀草素苷等黃酮類(lèi)化合物［2］，現(xiàn)已有用水蔓菁制成的片劑，臨床用于治療慢性氣管炎、肺化膿癥、咳吐膿血、急性腎炎、尿路感染等疾?。?］。但是片劑存在服用量大，生物利用度低等問(wèn)題。為滿足臨床用藥的需要，本課題組提取出水蔓菁的有效部位，制備成滴丸(制備方法另文撰述)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)水蔓菁滴丸中總黃酮和木犀草素含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，以希望用總黃酮含量和木犀草素含量對(duì)水蔓菁滴丸質(zhì)量進(jìn)行控制并為該藥制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

儀器:LC-20A高效液相色譜儀 (日本島津);質(zhì)譜儀:Quattro Premier Waters—2659(美國(guó)Waters公司);紫外分光光度計(jì)(上海菁華儀器);760CRT雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密分析儀器廠);FA1004電子天平(上海分析天平儀器廠);真空干燥箱(DEG-402型天津天宇技術(shù)實(shí)業(yè)有限公司)。

試藥:乙腈為色譜純?cè)噭?磷酸、氯仿、甲醇、甲酸、三氯化鋁、醋酸鉀均為分析純;蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所批號(hào):1521-200401);木犀草素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所批號(hào):1477-200418);水蔓菁藥材，經(jīng)山西省藥檢所鑒定為細(xì)葉婆婆納屬水蔓菁，產(chǎn)自山西省萬(wàn)榮縣。

2 方法與結(jié)果

2.1 可見(jiàn)分光光度法測(cè)定水蔓菁滴丸中總黃酮含量［4，5］

2.1.1 供試品溶液的配制

對(duì)照品溶液的制備:精密稱(chēng)取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品3.1 mg，置50 mL量瓶中，加適量60%乙醇，超聲使之溶解，再用60%乙醇稀釋至刻度，得對(duì)照品溶液(0.062 mg/mL)。

樣品溶液的制備:取水蔓菁滴丸15粒，研細(xì)，過(guò)80目篩，精密稱(chēng)取滴丸粉末0.05 g，置25 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲使之溶解，加60%乙醇至刻度并搖勻。精密量取1 m L，置10 mL量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻即得。

2.1.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精密吸取樣品溶液及對(duì)照品溶液各1.0 mL，分別置10 mL量瓶中，0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL，0.1 mol/L KAc溶液3 mL，再加60%乙醇至刻度，放置30 min。在200 nm～500 nm范圍內(nèi)掃描得測(cè)定波長(zhǎng)為410 nm。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

分別精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置10 mL量瓶中，各加0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL，0.1 mol/L KAc溶液3 mL，再加60%乙醇至刻度，搖勻，放置30 min，在410 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，以濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.034 9X－0.000 5，r=0.999 9，表明蘆丁濃度在 3.1 ～24.8 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.4 顯色穩(wěn)定性考察

量取蘆丁對(duì)照品液2 mL，按2.1.3項(xiàng)下方法，顯色10 min后，每隔5 min測(cè)其吸光度值。結(jié)果表明，前20 min吸收度增大速度快，30～40 min吸光度穩(wěn)定。故確定顯色時(shí)間為30 min。

2.1.5 精密度考察

取蘆丁對(duì)照品溶液，按2.1.3項(xiàng)下方法，重復(fù)進(jìn)行5次試驗(yàn)，結(jié)果表明，RSD為0.32%，儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性考察

精密稱(chēng)取同一批水蔓菁滴丸，按樣品溶液的制備方法，平行制備6份供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，RSD為1.1%，本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 回收率試驗(yàn)

取已知總黃酮含量的水蔓菁滴丸，分別加入高、中、低劑量的蘆丁對(duì)照品，按樣品溶液的方法制備供試液，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 水蔓菁滴丸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

結(jié)果表明:水蔓菁滴丸回收率符合方法學(xué)要求，方法準(zhǔn)確可行。

2.1.8 水蔓菁滴丸總黃酮含量測(cè)定

分別取3批滴丸各15粒，研細(xì)，稱(chēng)取滴丸粉末約0.05 g各3份，精密稱(chēng)定，按2.1.1項(xiàng)下方法制備樣品溶液，同2.1.3項(xiàng)下操作，得水蔓菁滴丸中總黃酮平均含量為:6.17% ±0.3%。

2.2 樣品水解成分結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)制備的水蔓菁滴丸中目前沒(méi)有可用于高效液相法進(jìn)行含量測(cè)定的特征性成分。但其含有木犀草素苷，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其水解產(chǎn)物中含有木犀草素。

根據(jù)對(duì)水解時(shí)間，所加水解溶劑的體積、濃度等方面的考察［6］，最終確定水解條件為，精密稱(chēng)取0.5 g水蔓菁滴丸粉末，置50 mL錐形瓶中，精密加入15 mL的2.5 mol/L的鹽酸甲醇液，水解1 h，放冷后補(bǔ)足重量，過(guò)濾，取濾液0.2 mL，置50 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。對(duì)水解液分別進(jìn)行質(zhì)譜法、薄層色譜法及高效液相法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.2.1 質(zhì)譜法進(jìn)行樣品水解成分結(jié)構(gòu)鑒定［7，8］

從圖1～4可知木犀草素對(duì)照品與水解樣品中結(jié)構(gòu)一致。木犀草素對(duì)照品碎片中含有285.13的峰，變換電壓后，有285.13、133.08兩個(gè)峰;而水解樣品中，相應(yīng)的有285.07的峰，變換電壓后有285.29和132.98兩個(gè)峰，與木犀草素對(duì)照品相對(duì)應(yīng)，初步確定水解樣品中含有木犀草素成分。

圖1 木犀草素對(duì)照品質(zhì)譜圖1

圖2 木犀草素對(duì)照品質(zhì)譜圖2

圖3 水蔓菁滴丸水解樣品質(zhì)譜圖1

圖4 水蔓菁滴丸水解樣品質(zhì)譜圖2

2.2.2 硅膠薄層鑒別

取木犀草素對(duì)照品加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液作為對(duì)照品溶液1。取水蔓菁滴丸的甲醇溶液，作為供試液2。取水蔓菁滴丸水解液兩份，濃縮，用甲醇溶解作為供試液3，4。吸取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以CHCl3-甲醇-甲酸(20∶4∶0.8)為展開(kāi)劑，置預(yù)飽和15 min的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干，噴三氯化鋁試液，置紫外光燈(365 nm)下檢視發(fā)現(xiàn)［9］，供試液3和4斑點(diǎn)中，在與對(duì)照品相同比移值位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而供試品2在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，無(wú)熒光斑點(diǎn)，說(shuō)明水蔓菁水解液中存在木犀草素。

2.2.3 高效液相法對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行定性鑒別

用反相高效液相法對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行定性鑒別后，發(fā)現(xiàn)對(duì)照品與水解產(chǎn)物在9.8min均有保留峰出現(xiàn)(見(jiàn)圖5、圖6)。說(shuō)明水解樣品中含有木犀草素。

圖5 木犀草素對(duì)照品HPLC色譜圖

圖6 水蔓菁滴丸HPLC圖

2.3 HPLC法測(cè)定水蔓菁滴丸中木犀草素含量［10］

2.3.1 色譜條件

色譜柱:C18(5μm，4.6 mm×250 mm)(迪馬公司);測(cè)定波長(zhǎng):350 nm;流動(dòng)相:乙腈-0.4%磷酸(30∶70);流速:1.0 mL/min;柱溫:23℃。

2.3.2 對(duì)照品和供試品溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備:精密稱(chēng)取木犀草素對(duì)照品約1.6 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻。制成木犀草素濃度為32μg/mL的對(duì)照品溶液。

供試品溶液:精密稱(chēng)取0.5 g水蔓菁滴丸粉末，置于50 mL錐形瓶中，精密加入15 mL的2.5 mol/L的鹽酸甲醇液，水解1 h，放冷后補(bǔ)足重量，過(guò)濾，取濾液0.2 mL，置50 mL量瓶，用甲醇定容，搖勻，即得。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

分別精密量取木犀草素對(duì)照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，吸取上述溶液各20μL進(jìn)樣，以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸計(jì)算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=2 863 820.99X－7 169.2，r=0.999 4，試驗(yàn)結(jié)果表明:木犀草素在3.2～64μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣20 μL，測(cè)得樣品中木犀草素峰面積值，結(jié)果表明:供試品溶液3～8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

精密量取同一份木犀草素對(duì)照品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，木犀草素峰面積的RSD為0.6%。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批水蔓菁滴丸6份，按2.3.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，平行制備6份供試液，分別進(jìn)樣20μL，RSD值為0.6%。

2.3.7 回收率試驗(yàn)

取已知木犀草素含量的滴丸約1.5 g，精密稱(chēng)定，置50 mL錐形瓶中，按2.3.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制備供試液后，分別加入木犀草素對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣20μL，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.8 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取水蔓菁滴丸粉末0.5g3份，按2.3.2項(xiàng)操作，制備供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果水蔓菁滴丸中木犀草素的含量為0.22%±0.02%。

表2 水蔓菁滴丸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用可見(jiàn)分光光度法和HPLC法建立了水蔓菁滴丸總黃酮和木犀草素含量的測(cè)定方法，該測(cè)定方法合理、準(zhǔn)確、方便可行，可以為該藥制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考，并為該藥的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海:上海科技出版社，1986:1032.

［2］馬翠英.水蔓菁中黃酮類(lèi)化合物的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1991，26(3):203-208.

［3］楊丁銘，朱開(kāi)賢.水蔓菁的化學(xué)成分研究(Ⅱ)［J］.中草藥，1991，(22):2-4.

［4］揭金階.羅布麻葉總黃酮類(lèi)化合物的提取及含量測(cè)定［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26(12):1490-1491.

［5］楊榮平，李 琳.紫外分光光度法測(cè)定補(bǔ)骨脂中總黃酮含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2007，16(1):22-23.

［6］李英霞.正交試驗(yàn)法優(yōu)選濟(jì)菊木犀草素提取工藝［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2001，1(12):5-8.

［7］晏 媛.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)復(fù)方蒲公英灌腸液的色譜指紋圖譜的分析［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25(4):447-449.

［8］李 峰.水蔓菁揮發(fā)油成分的氣相色譜/質(zhì)譜分析［J］.分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2002(30):822-825.

［9］金繼曙.龍須草花中木犀草素成分的利用研究［J］.中草藥，1994，10(25):553-554.

［10］孔令鈺，于治國(guó).RP-HPLC測(cè)定苦碟子藥材中木犀草素的含量［J］.中成藥，2007，29(7):1063-1064.