霍乃蕊，岳文斌，劉玉花，馬儷珍，孔保華

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，太谷030801;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱150030;3.天津農(nóng)學(xué)院食品系，天津 300384)

羊骨木瓜蛋白酶水解物對(duì)小鼠免疫功能的影響

霍乃蕊1，岳文斌1，劉玉花2，馬儷珍3，孔保華2

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，太谷030801;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱150030;3.天津農(nóng)學(xué)院食品系，天津 300384)

目的 探討不同劑量的羊骨木瓜蛋白酶水解物對(duì)健康小鼠免疫功能的影響。方法 按體質(zhì)量將ICR 小鼠分成對(duì)照組(0 g/(kg·bw))及低(0.5 g/(kg·bw))、中(1.0 g/(kg·bw))、高(3.0 g/(kg·bw))3 個(gè)劑量組，分別以碳粒廓清試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)評(píng)價(jià)水解物對(duì)非特異性免疫和體液免疫的影響;以噻唑藍(lán)分光光度法評(píng)價(jià)低(0.01 mg/mL)、中(0.1 mg/mL)、高(1 mg/mL)不同濃度水解物對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響。結(jié)果 只有中劑量水解物才能顯著提高吞噬細(xì)胞的吞噬能力;3個(gè)劑量組小鼠脾細(xì)胞的抗體生成量均顯著高于對(duì)照組，但高劑量組顯著低于中、低劑量組;3個(gè)濃度的酶解物均能促進(jìn)體外ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖活性，但高濃度的促分化效果不如低濃度和中濃度。結(jié)論 羊骨木瓜蛋白酶水解物能增強(qiáng)小鼠的特異性和非特異性免疫功能，但這種免疫促進(jìn)作用與劑量并不呈線性關(guān)系。

羊骨;木瓜蛋白酶水解物;ICR小鼠;免疫功能

免疫活性肽是繼中草藥、多糖、植物提取物、維生素［1－5］、礦物質(zhì)等后被發(fā)現(xiàn)的新型免疫增強(qiáng)劑，其來源廣泛，又可利用現(xiàn)代生物技術(shù)特別是酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。

我國為畜產(chǎn)大國，畜骨的利用率極低，目前多用于動(dòng)物飼料。占骨骼蛋白90%的膠原蛋白，經(jīng)酶水解可生成膠原多肽和氨基酸。不同酶解工藝制備的膠原多肽，其消化吸收率可達(dá)100%，并且具有抑制血壓上升、預(yù)防骨質(zhì)疏松、抑菌及促進(jìn)皮膚膠原代謝等功能。研究表明酶法水解酪蛋白、大豆、玉米胚芽、牛乳蛋白、雞蛋清、面筋蛋白等所得的水解物中都含有免疫調(diào)節(jié)肽，可增強(qiáng)正常動(dòng)物或免疫力低下動(dòng)物的免疫功能［6－9］。關(guān)于羊骨膠原肽對(duì)機(jī)體免疫力的調(diào)節(jié)作用還未見報(bào)道，本研究對(duì)羊骨膠原木瓜蛋白酶水解物對(duì)小鼠的非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)并探討量效關(guān)系，進(jìn)而為保健食品開發(fā)和實(shí)現(xiàn)畜骨的深度開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮羊骨(天津中敖食品集團(tuán)公司)、木瓜蛋白酶 (60 000 U/g，天津市諾奧酶制劑公司)、RPMI－1640不完全培養(yǎng)液(Gibco)、胎牛血清(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所)、噻唑藍(lán)(MTT)、ConA(Sigma公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(津)2005－0001】。在光線暗的安靜環(huán)境中塑料飼養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為(24±2)℃，相對(duì)濕度40% ～60%，自由采食和飲水。飼料為天津市華榮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供的基礎(chǔ)飼料。豚鼠，體質(zhì)量300～400 g，購自天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心【SYXK(津)2008－0005】。實(shí)驗(yàn)過程中遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則并給予小鼠和豚鼠人道主義關(guān)懷。

1.3 樣品制備

通過正交試驗(yàn)，以酶解物對(duì)T淋巴細(xì)胞的促轉(zhuǎn)化能力為篩選指標(biāo)，確定了最佳酶解條件:羊骨骨粉的底物濃度為0.271 kg/L，木瓜蛋白酶添加量為1576 U/g，64.05℃酶解7.22 h，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴滅酶5 min，3500 r/min離心10 min，上清液冷凍干燥成粉末。

1.4 非特異性免疫試驗(yàn)(碳粒廓清試驗(yàn))

32只ICR健康小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組:對(duì)照組以及低、中、高3個(gè)劑量組。干物質(zhì)溶于生理鹽水中，每天定時(shí)等體積灌胃1次，灌胃的干物質(zhì)分別為 0、0.5、1、3 g/(kg·bw)，連續(xù)灌胃 14 d。末次灌胃24 h后，按0.01 mL/g體重尾靜脈注射用生理鹽水4倍稀釋的印度墨汁，在第2 min、第10 min從內(nèi)眥靜脈叢采血20 μL，加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，搖勻。以0.1%Na2CO3溶液作空白對(duì)照，測(cè)A600值。將小鼠處死，取肝、脾，稱質(zhì)量。校正吞噬指數(shù)a的計(jì)算公式如下，式中K表示吞噬速率，t為不同采血時(shí)間。

1.5 體液免疫試驗(yàn)(溶血分光光度法)

豚鼠心臟采血，離心分離血清，置－20℃保存，臨用前以生理鹽水作1∶10稀釋。小鼠分組方法與灌喂劑量同1.4，連續(xù)30 d，第25天，用2%SRBC腹腔免疫小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，無菌操作摘取小鼠脾，剪碎，擠壓研磨，過200目篩，用PBS沖洗細(xì)胞，2000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL的紅細(xì)胞裂解液，靜置10 min，離心，再加入 PBS洗滌離心，最后加入2 mL的PBS懸浮。臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞濃度達(dá)到每毫升5×106個(gè)。取0.5 mL細(xì)胞懸液，加入0.2%SRBC和10%豚鼠血清各1 mL，混勻，對(duì)照管不加脾細(xì)胞懸液，以 PBS補(bǔ)充。37℃保溫1 h后，2500 r/min離心10 min，取上清液于430 nm處測(cè)光吸收值。

1.6 細(xì)胞免疫試驗(yàn)(MTT比色分析法［3］)

將酶解物配置成1、0.1和0.01 mg/mL 3個(gè)濃度，MTT法測(cè)定其對(duì)小鼠脾 T淋巴細(xì)胞增殖(經(jīng)ConA誘導(dǎo))的影響。小鼠脾細(xì)胞懸液經(jīng)RPMI 1640不完全培養(yǎng)液洗滌3次后，細(xì)胞計(jì)數(shù)并用 RPMI 1640完全培養(yǎng)液(含10%小牛血清)稀釋至5×106cells/mL。在96孔酶標(biāo)板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸浮液。陰性對(duì)照孔中再加入20 μL的完全培養(yǎng)液;陽性對(duì)照孔中分別加入10 μL完全培養(yǎng)液和10 μL ConA;試驗(yàn)孔中加入 10 μL ConA 和 10 μL 酶解液。在5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前 6 h，每孔加入 10 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加100 μL 10%的 SDS終止反應(yīng)，37℃過夜，490 nm波長下測(cè)各孔的A值。免疫調(diào)節(jié)活性以刺激指數(shù)(stimulation index，SI)來表示。SI=樣品A值/陽性對(duì)照A值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠吞噬細(xì)胞吞噬能力的影響

校正吞噬指數(shù)a值代表了小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬能力，由表1可知:所有劑量組的 a值雖高于對(duì)照組，但只有中劑量組吞噬細(xì)胞吞噬碳顆粒的能力顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。因此劑量與吞噬能力之間沒有線性關(guān)系，只有在適當(dāng)劑量時(shí)，才有明顯的促吞噬能力，劑量過高或過低，對(duì)吞噬能力都沒有明顯的影響。

表1 酶解物對(duì)小鼠吞噬細(xì)胞吞噬能力的影響(n=8，xˉ±s)Tab.1 Effect of the hydrolysate on the phagocytic capacity of macrophages in the mice

2.2 對(duì)體液免疫的影響

持續(xù)灌胃30 d，各劑量組小鼠脾細(xì)胞特異性抗體的生成量顯著高于對(duì)照組(A430=0.00515±0.00212)，并且高劑量組(A430= 0.01518±0.00670)顯著低于低劑量組(A430= 0.03575±0.01680)和中劑量組(A430=0.02220±0.00470)，P＜0.05，而低劑量組和中劑量組差異不顯著(P＞0.05)。說明隨著灌胃劑量的增加，酶解物對(duì)體液免疫的促進(jìn)作用有逐漸降低的趨勢(shì)。

2.3 酶解物對(duì)細(xì)胞免疫的影響

陽性對(duì)照孔的刺激指數(shù)(SI)設(shè)定為1，在體外實(shí)驗(yàn)中，低(0.01 mg/mL)、中(0.1 mg/mL)、高(1 mg/mL)3個(gè)劑量孔的SI值均大于1，分別為(1.18±0.06)、(1.24±0.03)和(1.01±0.04)，說明各濃度的酶解物均可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，但中劑量的刺激指數(shù)顯著高于對(duì)照組和其他兩個(gè)劑量組。

3 討論

免疫分為固有免疫和適應(yīng)性免疫兩種類型［4］。適應(yīng)性免疫即特異性免疫又分為體液免疫和細(xì)胞免疫［10］。評(píng)價(jià)某種物質(zhì)對(duì)免疫功能的影響時(shí)，應(yīng)該對(duì)組成免疫力的上述三方面進(jìn)行全面評(píng)價(jià)［11］，每一方面的評(píng)價(jià)又有許多不同的方法，本研究分別選取了碳粒廓清試驗(yàn)、定量溶血試驗(yàn)以及MTT法對(duì)免疫力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3.1 酶解物對(duì)小鼠非特異性免疫功能的影響

吞噬細(xì)胞主要由中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞組成，其吞噬能力是構(gòu)成非特異性免疫的要素之一［4］，吞噬細(xì)胞也是一類主要的抗原呈遞細(xì)胞，在特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，校正吞噬指數(shù)可反映吞噬能力的強(qiáng)弱和非特異性免疫功能的變化。中劑量羊骨膠原酶解物可顯著提高小鼠外周血中吞噬細(xì)胞清除碳顆粒的能力，因而具有增強(qiáng)非特異性免疫的功能。其機(jī)理可能是小肽作為一種免疫激活劑，激活大量處于靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞，同時(shí)又顯著提高了已經(jīng)處于活化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞的吞噬功能［12］。

3.2 酶解物對(duì)小鼠體液免疫功能的影響

抗體水平是反映機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)［14］。在SRBC刺激下，脾臟B細(xì)胞活化、增殖、分化為漿細(xì)胞并分泌各類特異性免疫球蛋白即抗體，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。在體外，抗SRBC抗體與SRBC特異性結(jié)合，在補(bǔ)體的參與下導(dǎo)致紅細(xì)胞裂解，發(fā)生溶血，所釋放的血紅蛋白量可反映抗體的生成量，在一定程度上代表了機(jī)體的體液免疫水平。本研究中酶解物能顯著提高各劑量組小鼠的體液免疫應(yīng)答能力，同從羊胎盤中提取的小分子肽一樣對(duì)體液免疫具有正調(diào)節(jié)作用［14］。檢測(cè)體系中，各處理組B淋巴細(xì)胞的數(shù)量是一樣的，A值不同由抗體分泌量不同引起，因此羊骨酶解物可提高漿細(xì)胞分泌特異性抗體的能力，是否和羊胎盤肽一樣還具有促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖和分化的能力，還有待進(jìn)一步研究。

3.3 酶解物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

四甲基偶氮唑(MTT)比色分析法簡(jiǎn)便、迅速、準(zhǔn)確，已廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞毒性、細(xì)胞活性以及細(xì)胞增殖試驗(yàn)［16］。刀豆蛋白 A(concanavalin A，ConA)為T細(xì)胞絲裂原，激活并促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖。細(xì)胞在增殖過程中，能量代謝增加，酶促反應(yīng)隨之加強(qiáng)，MTT被活細(xì)胞的線粒體脫氫酶降解而產(chǎn)生紫色物質(zhì)，因此MTT法可定量分析細(xì)胞增殖。本研究主要考察了酶解物與ConA協(xié)同刺激脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖作用。各濃度的酶解物對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖都有促進(jìn)作用，但中劑量最強(qiáng)，高劑量最弱。研究酪蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖呈現(xiàn)一定的濃度效應(yīng)，每種產(chǎn)物都有其最適作用濃度［6，7］，這與本文的研究結(jié)果一致，這種情況也類似于ConA，ConA在高濃度時(shí)其促轉(zhuǎn)化能力反而也有所降低［17］，可能與細(xì)胞死亡有關(guān)。

綜上所述，羊骨膠原木瓜蛋白酶水解物可增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答能力，但這種促進(jìn)作用與濃度并非呈正比，關(guān)于羊骨膠原活性肽增強(qiáng)免疫的機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

［1］ 宋曉東，辛穎，劉哲.芪紅膠囊通過免疫調(diào)節(jié)治療病毒性心肌炎小鼠［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2009，17:85－89.

［2］ 王立為，呂光華，劉新民，等.參藿口服液對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的影響［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2004，14:342－344.

［3］ 高仕英，吳紀(jì)經(jīng)，吳英華.酵母多糖對(duì)肉用仔雞免疫系統(tǒng)的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2000，8:185－189.

［4］ 郭靜，許建寧，王全凱，等.大豆提取物(CKBN)對(duì)免疫低下小鼠免疫功能的影響［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18:45－49.

［5］ Puthpongsiriporn U，Scheideler SE，Sell JL，et al.Effects of vitamin E and C supplementation on performance，in vitro lymphocyte proliferation，and antioxidant status of laying hens during heat stress［J］.Poultry Sci，2001，80:1190－1200.

［6］ Mao XY，Ren YH，Li YH，et al.Growth－inhibiting activity of casein and its hydrolysate to tumor cells［J］.Milehwissenschaft，2006，61:128－131.

［7］ Mao XY，Yang HY，Song JP，et al.Effect of yak milk casein hydrolysate on Th1/Th2 cytokines production by murine spleen lymphocytes in vitro［J］.J Agr Food Chem，2007，55:638－642.

［8］ 楊小軍，左偉勇.灌喂大豆蛋白胃蛋白酶酶解物對(duì)大鼠免疫功能的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36:348－351.

［9］ Clare DA，Swaisgood HE.Bioactive milk peptides:A prospectus［J］.J Dairy Sci.2000，83(6):1187－1195.

［10］ 王冬平，欒蓉暉，李善如，等.BALB/c突變無毛小鼠特異性免疫功能的研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2003，11:23－25.

［11］ 鄭建仙，主編.功能性食品(第三卷)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1998，104－132.

［12］ 張華，張爽，蔡亞平，等.羊胎盤肽對(duì)小鼠非特異性免疫功能的影響［J］.中國生化藥物雜志，2007，28:266－268.

［13］ 陳 瑜，李春花，仝品芬，等.不同年齡階段實(shí)驗(yàn)恒河猴免疫球蛋白 IgG、IgM、IgA及補(bǔ)體 C3、C4的測(cè)定分析［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16:257－259.

［14］ 方廖瓊，鐘英英，張華，等.羊胎盤免疫調(diào)節(jié)因子對(duì)小鼠體液免疫的影響［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，30:356－358.

［15］ Mosmann TR.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.Immunol Methods，1983，65:55－63.

［16］ Nakamura A，Nagai K，Suzuki S，et al.A novel method of screening for immunomodulating substances:establishment of an assay system and its application to culture broths of microorganisms［J］.J Antibiotics，1986，39:1148－1155.

［17］ 何玉琴，楊小燕，林淑慧，等.雞脾臟T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)優(yōu)化條件的篩選［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29:47－49.

Immunomodulatory Effect of Papain Hydrolysate Originated from Sheep Bone on Mice

HUO Nai－rui1，YUE Wen－bin1，LIU Yu－h(huán)ua2，MA Li－zhen3，KONG Bao－h(huán)ua2
(1.Shangxi Agricultural University，Taigu 030801，China;2.Northeast Agricultural University，Harbin 150030;3.Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384)

ObjectiveTo evaluate the effect of papain hydrolysates originated from sheep bone on the immunity of healthy mice.MethodsICR mice were divided by body mass into control(0 g/kg)，low－dose(0.5 g/kg)，mediumdose(1.0 g/kg)and high－dose(3.0 g/kg)groups.Carbon clearance test and quantitative SRBC hemolysis test were used to determine the impact of the hydrolysates on mice innate immunity and humoral immunity，respectively，and MTT assay was used to determine the effect of low(0.01 mg/mL)，medium(0.1 mg/mL)，high(1 mg/mL)concentration of the hydrolysates on the cell－mediated immunity(CMI).ResultsOnly the hydrolysate of medium dose group significantly enhanced the phagocytic capacity of macrophages.The amounts of antibodies produced by splenic cells of all dosage groups were markedly higher than that of the control group，while antibodies produced by high－dose group were significantly lower than the other two groups.Supplementation of different concentrations of hydrolysates significantly enhanced lymphocyte proliferation in response to ConA stimulation in vitro，but high concentration was not as good as low and medium concentration.ConclusionsSheep bone collagen papain hydrolysates has a potential to enhance both the specific and innate immunity of normal mice，but this kind of immunomodulatory activity shows no linear relationship with the dosage administrated.

Sheep bone;Papain hydrolysate;ICR mice;Immunity

R－33

A

1005－4847(2010)05－0417－04

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.05.013

2010－01－25

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(編號(hào):XB2009019);天津市科技攻關(guān)項(xiàng)目“羊肉新技術(shù)應(yīng)用與產(chǎn)品開發(fā)和工程示范”(編號(hào):05ZHGCNC00100)。

霍乃蕊(1972－)，女，副教授，博士.研究方向:食品生物技術(shù)。Email:tgnrhuo@163.com

馬儷珍，Email:malizhen－6329@163.com