郭學(xué)軍，陳苑，巫志鋒，張永斌，鄒移海

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510405;2.廣東省中醫(yī)院，廣州 510405)

原花青素對(duì)腦缺血再灌損傷大鼠模型的影響

郭學(xué)軍1，陳苑1，巫志鋒2，張永斌1，鄒移海1

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510405;2.廣東省中醫(yī)院，廣州 510405)

目的 研究原花青素對(duì)腦缺血/再灌損傷(ischemia/reperfusion，I/R)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分(neurological deficit score，NDS)、腦梗死體積、腦含水量等指標(biāo)的藥理作用。方法 采用大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷(middle cerebral artery occlusion，MCAO)法復(fù)制類似人類缺血性卒中的I/R損傷模型。結(jié)果 該模型各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)均有程度不同的神經(jīng)功能缺失，原花青素給藥組神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，假手術(shù)組大鼠均無神經(jīng)功能缺失，腦水腫情況均較對(duì)照組明顯改善(P＜0.05)，腦梗死體積與鹽水對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，而假手術(shù)組均未見有梗死灶。結(jié)論 原花青素具有一定的保護(hù)大鼠I/R后受損腦組織的作用，可供后續(xù)研究，并可為缺血性卒中使用原花青素治療提供確鑿的理論依據(jù)。

原花青素;腦缺血;再灌注損傷;神經(jīng)生長因子

腦血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)是危害人類健康及生命的三大疾病之一。我國CVD的患病率約為5.0%，發(fā)病率約為2.0%，且有緩慢上升的趨勢，每年新發(fā)病例超過150萬例。缺血性腦血管病(ischemic cerebral vascular disease，ICVD)是其中常見的一類，約占56.6% ～80.0%，在祖國醫(yī)學(xué)中，屬于腦卒中的范疇，不僅西醫(yī)治療該疾病有相關(guān)的治療方案，而且關(guān)于ICVD的中藥及植物提取物治療也有相當(dāng)長的研究歷史。臨床上治療ICVD的單味中藥大多屬于活血化淤的范疇，如川芎、丹參、當(dāng)歸、三七、地龍、水蛭等。用于治療ICVD常用的復(fù)方制劑劑型除傳統(tǒng)的口服煎劑、丸劑、片劑、膠囊劑、口服液、沖劑、膏劑、散劑、丹劑外，涂膜劑之外，其他給藥途徑也很豐富。如采用中藥離子導(dǎo)入、中藥灌腸劑，尤其是中藥注射劑型，如清開靈、醒腦靜、血塞通、生脈、腦絡(luò)靈、絡(luò)泰、路路通、心腦新等注射液［1］的開發(fā)應(yīng)用大大提高了中藥治療 ICVD的成功率。

因此，中藥、天然藥物在 CVD的臨床治療方面具有明顯的開發(fā)優(yōu)勢，原花青素的現(xiàn)代藥理研究表明，其提取物具有抗氧化劑活性、酶抑制活性、抗致突變活性、降低毛細(xì)血管通透性(抗炎活性)、心血管活性等多方面的藥理作用［2－5］，而當(dāng)腦缺血缺氧發(fā)生后，一系列損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)生將導(dǎo)致腦組織的損害［6］，故可以延伸為此方面的應(yīng)用，但是原花青素或其提取物是否具有確切的腦保護(hù)效應(yīng)，未見國內(nèi)外報(bào)道過相關(guān)的動(dòng)物基礎(chǔ)研究。本研究采用大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷致局灶性I/R損傷模型，此模型與人類缺血性卒中較為類似，從神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積、腦含水量等方面研究原花青素對(duì)大鼠 I/R后的藥理作用，為使用原花青素治療缺血性卒中提供確鑿的理論依據(jù)，從而拓寬其應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

SPF 級(jí) SD(Sprague－Dawley，SD)雄性大鼠 120只，體質(zhì)量270～300 g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK(粵)2008－0020］，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室［SYXK(粵)2008－0001］。飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為 18～22℃，室內(nèi)濕度保持在 50% ～70%，每天日照時(shí)間為8:00～20:00。

1.2 材料

原花青素由深圳市安心植物科技有限公司提供，使用前與0.3%CMC－Na配成混懸液供測試用(含 量 為 5 mg/mL)。TTC(2，3，4－triphenyl－2H－tetrazolium，氯化 2，3，5－三苯基四氮唑)購自廣州化學(xué)試劑分裝部，分析純，批號(hào):200107214。Olympus光學(xué)顯微鏡(日本)，BI－2000型圖像采集分析系統(tǒng)(成都泰盟)，Sartorius 320－A型電子分析天平(德國)。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模方法:120只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)值表分為假手術(shù)組40只，缺血對(duì)照組40只，原花青素治療組40只。缺血對(duì)照組與假手術(shù)組給予等體積等滲生理鹽水。采用稍加改良的Zea－longa0線栓法制備大鼠MCAO模型。栓線采用單沙尼龍線長4 cm直徑0.255 mm，一頭頂端用火燒鈍，去棱角使其光滑，使頂端直徑約0.26 ～0.28 mm，并距頭端18 mm處作一標(biāo)記。酒精清潔后置于1%肝素鈉中備用。大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，以10%水合氯醛3 mg/kg體重腹腔注射麻醉，大鼠四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部備皮，常規(guī)消毒鋪洞巾，行頸部正中切口，逐層分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈 (internal carotid artery，ICA)、頸 外 動(dòng) 脈 (external carotid artery，ECA)，避免刺激迷走神經(jīng)。在 CCA、ICA、ECA上各置一根3/0絲線，在距 ICA、ECA分叉5 mm處結(jié)扎CCA，在 CCA根部結(jié)扎 ECA，提拉預(yù)置絲線阻斷 ICA血流，在其距 ICA、CCA分叉上剪一“V”形切口，將尼龍線燒鈍的一端小心沿切口插入，松開提拉線，徐徐向前進(jìn)18～20 mm，稍遇阻力即停止前進(jìn)。結(jié)扎ICA留置絲線，防栓子脫落。然后逐層縫合皮膚，術(shù)后2 h將尼龍線從ICA中撤出，直至頭端退至CCA分叉處(感阻力)，進(jìn)行1、24及72 h再灌注，假手術(shù)組僅將栓線插入10 mm使尼龍線置于ICA而未進(jìn)入MCA，其余步驟同前。術(shù)中保持肛溫(37±0.5)℃，模型成功的標(biāo)志是大鼠即刻出現(xiàn)Horner征。凡術(shù)中動(dòng)物死亡、出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血或無梗死灶均為MCAO模型制作失敗，不納入本實(shí)驗(yàn)，再隨機(jī)補(bǔ)充病例，保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每組數(shù)量不變。原花青素治療組在缺血前1 h及再灌損傷前1 h分別給予原花青素(10 mL/kg)灌胃預(yù)防給藥。

1.3.2 觀察指標(biāo)及檢測方法

(1)神經(jīng)功能評(píng)分

于處死前參考 Zea－Longa等的 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［7］:0分:無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀，活動(dòng)基本正常。1分:不能完全伸展左側(cè)前爪。2分:爬行時(shí)出現(xiàn)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈。3分:行走時(shí)向偏癱側(cè)(左側(cè))傾倒。4分:不能自動(dòng)行走，有意識(shí)障礙。在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)由協(xié)作者盲法評(píng)分。

(2)腦梗死區(qū)含水量測定

采用 Rosenberg［8］方法，采用干濕重法，在缺血再灌注12 h后行過量麻醉，直接斷頭后取缺血側(cè)自Bregma點(diǎn)向前取5 mm2大小腦組織腦組織，用濾紙吸去表面液體，分別用電子天平稱其濕重(室溫15～20℃，相對(duì)濕度為70% ～90%)，然后將腦組織置于電熱烤箱(100±21)℃內(nèi)48 h烘干并衡重，迅速測干重，按下式計(jì)算:

(3)腦梗死體積測定

紅四氮唑(2，3，5－triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法染色。實(shí)驗(yàn)大鼠在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)作神經(jīng)功能評(píng)分后，用10%水合氯醛3 mg/kg靜脈麻醉后迅速開胸，經(jīng)左心室插管灌入生理鹽水50 mL，繼之灌以溫生理鹽水配制的2%TTC 80 mL，灌注時(shí)大鼠浸在37℃水中，持續(xù)30 min，而后灌注4%多聚甲醛200 mL，持續(xù)1 h左右，開顱取腦。TTC被腦組織線粒體內(nèi)過氧化氫酶還原，可使正常腦組織被染成深紅色，梗死灶為白色。將固定后的腦組織由前至后每隔2 mm厚度作冠狀面切開，按 Swanson［9］間接法測定，即按順序依次由前向后，由掃描儀將圖像信息輸入計(jì)算機(jī)，用圖像采集分析系統(tǒng)分別測定腦梗死面積，輸入片厚參數(shù)，計(jì)算出梗死體積 (mm3)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)改變

從表1可看出，術(shù)后存活大鼠I/R 1h后均有程度不同的神經(jīng)功能缺失，原花青素治療組神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，假手術(shù)組大鼠均無神經(jīng)功能缺失。

2.2 腦含水量變化

除假手術(shù)組外，各組在I/R后1 h腦含水量就開始增加，到I/R后24 h，鹽水對(duì)照組與原花青素用藥組的腦組織含水量均達(dá)峰值。在I/R后72 h有所回落。原花青素用藥組在I/R后各時(shí)間點(diǎn)腦水腫情況均較對(duì)照組明顯改善(P＜0.05)，見表1。

表1 原花青素對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響(±s，n=40)Tab.1 Impact of procyanidins on the neurological deficit score in rats

表1 原花青素對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響(±s，n=40)Tab.1 Impact of procyanidins on the neurological deficit score in rats

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05Note:compared with the control group，*P＜0.05

組別Groups神經(jīng)功能評(píng)分(Neurological deficit score)1 h 24 h 72 h對(duì)照組(Control group)1.92±0.36 3.11±0.87 3.02±0.43原花青素組(Procyanidins group) 1.54±0.21*1.76±0.37*2.57±0.62*假手術(shù)組(Sham－operated group)000

表2 原花青素對(duì)大鼠腦含水量的影響(±s，n=40)Tab.2 Impact of procyanidins on brain water content in rats

表2 原花青素對(duì)大鼠腦含水量的影響(±s，n=40)Tab.2 Impact of procyanidins on brain water content in rats

注:與假手術(shù)組比較，#P＜0.05;與對(duì)照組比較，△P＜0.05Note:Compared with the sham－operated group，*P ＜ 0.05;Compared with the control group，*P＜0.05

腦含水量(%)(Brain water content)1 h 24 h 72 h對(duì)照組(Control group) 77.20±0.35# 86.5±0.63# 81.55±0.62組別Groups#原花青素組78.32±0.41手術(shù)組(Sham－operated group)75.41±0.28 77.11±0.37 77.38±0.70(Procyanidins group) # 82.17±0.82#△ 79.41±0.74#△假

2.3 腦梗死體積

原花青素治療組I/R后各時(shí)間點(diǎn)梗死體積與鹽水對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，兩組在 I/R假手術(shù)組均未見有梗死灶。見表3。

表3 原花青素對(duì)大鼠腦梗死體積的影響(±s，n=40)Tab.3 Impact of procyanidins on volume of cerebral infarction in rats

表3 原花青素對(duì)大鼠腦梗死體積的影響(±s，n=40)Tab.3 Impact of procyanidins on volume of cerebral infarction in rats

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05Note:compared with the control group，*P＜0.05

腦梗死體積(mm3)Volume of cerebral infarction(mm3)組別Groups1 h 24 h 72 h對(duì)照組(Control group)106.0±9.7 136.5±11.3 162.7±17.8原花青素組(Procyanidins group) 98.4±8.5 107.3±14.8*122.5±20.1*假手術(shù)組(Sham－operated group)000

3 討論

近期分子水平對(duì)缺血性卒中的研究資料表明，腦組織缺血缺氧發(fā)生后，是一系列損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)造成腦組織的進(jìn)一步損害，包括興奮毒性氨基酸釋放，Ca2+超載，炎癥反應(yīng)及促凋亡的發(fā)生。目前對(duì)于缺血性卒中的腦保護(hù)治療日益重視，主要通過降低一些腦缺血后損傷因子和增加一些保護(hù)因子及減少凋亡等達(dá)到保護(hù)缺血腦組織受損的目的［10－12］。目前利用大量離體和在體的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，已發(fā)現(xiàn)了許多中藥、天然藥物能通過干預(yù)上述某一損傷或保護(hù)環(huán)節(jié)，不同程度的減輕腦損傷，但是仍有大量中藥的基礎(chǔ)研究尚未系統(tǒng)的進(jìn)行，從而限制了臨床的應(yīng)用，而作為原花青素則是在此前提下提出的。本研究主要從神經(jīng)行為學(xué)和病理組織學(xué)方面研究原花青素對(duì)I/R缺血組織的保護(hù)效應(yīng)。

本文采用了與人腦血循環(huán)及再灌注損傷很接近的MCAO模型，在腦缺血2 h后再灌注。發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡率低，梗死灶及神經(jīng)功能較穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)中排除了術(shù)后無梗死灶大鼠2只，出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠5只。研究結(jié)果表明，原花青素能顯著促進(jìn)I/R后大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)，在 I/R后72 h更為顯著，大大改善了大鼠腦梗死后的預(yù)后。同時(shí)原花青素治療組還能顯著縮小I/R后腦梗死體積及顯著降低腦水腫的反應(yīng)，在I/R后24 h，原花青素減輕腦水腫反應(yīng)的效果更顯著。從而最直觀的從大體組織水平上顯示了原花青素對(duì)腦組織的保護(hù)作用，為受試動(dòng)物的神經(jīng)行為學(xué)改變提供了病理學(xué)依據(jù)。在I/R后1 h，我們發(fā)現(xiàn)無論是神經(jīng)行為，還是腦含水量及腦梗死體積，原花青素治療組與對(duì)照組之間均有顯著性差異，這可能因?yàn)樵谀X梗死的超早期，神經(jīng)細(xì)胞、細(xì)胞間隙內(nèi)的腦組織基質(zhì)受損都較輕，發(fā)生壞死及凋亡等變化的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞較少，炎癥反應(yīng)較輕，其神經(jīng)元的形態(tài)變化處于代償狀態(tài)，缺血區(qū)改變尚處于未完全受損的狀態(tài)，損傷的級(jí)聯(lián)反應(yīng)尚在啟動(dòng)中，原花青素在缺血即刻及再灌注即刻給予干預(yù)，能夠減弱損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)及再灌注損傷，提示原花青素可通過在腦梗死超早期給藥從而起干預(yù)治療的藥理作用。

［1］ 葛勤，田華，劉同華.中藥治療缺血性腦血管疾?。跩］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2004，23(2):111－112.

［2］ 由倍安，高海青.葡萄籽原花青素藥理研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)·老年醫(yī)學(xué)分冊(cè)，2003，24(3):123－127.

［3］ 馬亞兵，高海青.葡萄籽原花青素抗動(dòng)脈粥樣硬化研究進(jìn)展［J］.山東醫(yī)藥，2002，42:82－83.

［4］ 馬亞兵，高海青，由倍安，等.葡萄籽原花青素抗LDL氧化修飾作用的研究［J］.中華醫(yī)藥雜志，2003，3(11):961－963.

［5］ 馬亞兵，高海青，由倍安，等.葡萄籽原花青素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔血脂的調(diào)節(jié)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2004，20(3):325－359.

［6］ Bhardwaj A，Alkayed NJ，Kirsch JR，et al.Mechanisms of ischemic brain damage［J］.Curr Cardiol Rep，2003，5(2):160－167.

［7］ Zea－Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S， etal. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(2):84－91

［8］ Rosenberg GA， Scremin O， Estrada E， etal. Arginine vasopressin V1－antagonist and atrial natriuretic peptide reduce hemorrhagic brain edema in rats［J］.Stroke，1992，23(12):1767－1773.

［9］ Swanson RA，Morton MT，Tsao WG ，et al，A semiautomated method for measureing brain infarct volume［J］.Cereb Blood Flow Metab，1990，10:290－293.

［10］ 董為偉.神經(jīng)保護(hù)的基礎(chǔ)與臨床［M］.北京:科學(xué)出版社，2002，239－245.

［11］ Ovbiagele B，Kidwell CS，Starkman S，et al.Neuroprotective agents for the treatment of acute ischemic stroke［J］.Curr Neurol Neurosci Rep，2003，3(1):19－20.

［12］ Nils Gunnar，Wahigren，Patrick Lyden.Neuroprotectant in the treatment of stroke — An overview［J］.J Stroke Cerebrovasc Dis，2000，9:23－35.

Effects of Procyanidins on Ischemia/Reperfusion Brain Damage in Rats

GUO Xue－jun1，CHE Yuan1，WU Zhi－feng2，ZHANG Yong－bin1，ZOU Yi－h(huán)ai1
(1.Laboratory Animal Center，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China;2.Guangdong Provincial Hospital，Guangzhou 510405)

ObjectiveTo study the effects of procyanidins on neurological deficit score，cerebral infarction volume，and cerebral water content after ischemia/reperfusion(I/R)in rats.MethodsThe middle cerebral artery occlusion(MCAO)－induced focal I/R brain damage model of rats similar to human ischemic stroke was used.ResultsThe results showed that procyanidins lowered the neurological deficit score，cerebral infarction volume and cerebral water content significantly at intervals of 1 h，24 h and 72 h after I/R(P ＜ 0.05)，vs.control，while the sham－operated rats showed no infarction area.ConclusionsOur findings suggest that procyanidins show certain protective effect against I/R damage in the rat brain.Further studies of this effects are warranted to provide sufficient materials supporting the application of procyanidins in the treatment of ischemic stroke.

Procyanidins;Cerebral ischemia;Reperfusion injury;Nerve growth factor;Rat

R743.31，R332

A

1005－4847(2010)05－0425－04

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.05.015

2010－03－29

郭學(xué)軍(1976－)，男，助理研究員，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)和藥用動(dòng)物學(xué)的研究。E－mail:dwzxgxj@gzhtcm.edu.cn