武欣，谷涌泉，段紅永，陳兵，李建新，吳英鋒，張淑文，汪忠鎬，張建

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院血管外科，北京 100053)

利用脫細(xì)胞血管基質(zhì)體外構(gòu)建小口徑組織工程血管

武欣，谷涌泉，段紅永，陳兵，李建新，吳英鋒，張淑文，汪忠鎬，張建

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院血管外科，北京 100053)

目的 探討利用犬的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化種子細(xì)胞，以異種脫細(xì)胞血管基質(zhì)為基礎(chǔ)體外構(gòu)建小口徑血管移植物。方法 采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)的方法從犬骨髓中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞并體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化成內(nèi)皮樣細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞;采用非離子型去垢劑和胰蛋白酶去除豬頸動脈血管壁結(jié)構(gòu)細(xì)胞，對脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行組織學(xué)、力學(xué)檢測及孔隙率評估。在生物反應(yīng)器內(nèi)采用旋轉(zhuǎn)種植的方法將犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮樣細(xì)胞種植到脫細(xì)胞基質(zhì)上，體外構(gòu)建小口徑組織工程血管。結(jié)果 犬的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外能夠定向誘導(dǎo)分化為平滑肌樣細(xì)胞和內(nèi)皮樣細(xì)胞，可以作為血管組織工程的種子細(xì)胞。經(jīng)過脫細(xì)胞處理后，光鏡和電鏡觀察證實(shí)血管壁的細(xì)胞成分完全去除。具有良好的孔徑和孔隙率。支架在生物力學(xué)、孔隙率等方面符合構(gòu)建組織工程血管支架的要求。在生物反應(yīng)器內(nèi)剪切力條件下可以初步構(gòu)建出組織工程血管。結(jié)論 小口徑血管移植物可以將間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)種子細(xì)胞，以異種脫細(xì)胞血管支架作為基質(zhì)，在搏動性生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的方法進(jìn)行構(gòu)建。

間充質(zhì)干細(xì)胞;脫細(xì)胞;支架;生物反應(yīng)器;組織工程

血管疾病是世界上發(fā)病率最高的疾病之一，其主要的治療手段就是血管移植術(shù)。目前，血管移植術(shù)的主要適應(yīng)證有:晚期的動脈粥樣硬化性疾病、血管瘤性疾病、血管先天缺陷性疾病和創(chuàng)傷等。因此血管移植物的來源就成為人們關(guān)注的重要課題。目前臨床上應(yīng)用的血管移植物主要有三個來源:①自體血管;②異體血管;③人工材料。自體血管，包括大隱靜脈和內(nèi)乳動脈，組織相容性好，無免疫排異反應(yīng)，仍是血管移植物的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是動脈血管的供體有限，靜脈血管舒縮性差，易于形成血栓及血管瘤，靜脈或動脈的取材部位留下創(chuàng)口，形成二次創(chuàng)傷，因此其臨床應(yīng)用受到限制。異體血管包括異種血管和同種血管。異種血管來源雖然豐富，但移植后會產(chǎn)生強(qiáng)烈的超急性免疫排異，致使血管壁增生、血栓形成而使移植血管腔閉塞。同種血管存在供體不足及免疫排斥反應(yīng)的問題。人工血管移植物對于小口徑動脈移植的長期通暢率也不是十分滿意。所有這些原因，使我們意識到臨床需要小口徑血管替代物的重要性。

組織工程學(xué)的興起為從根本上解決以上問題帶來了新的曙光。1987年美國國家科學(xué)基金會正式提出和確定組織工程這一概念［1］，核心是利用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增種子細(xì)胞，種植于生物相容性好、并可降解的生物材料上，形成細(xì)胞—生物材料復(fù)合物，植入體內(nèi)與宿主組織融合生長，以達(dá)到對宿主組織結(jié)構(gòu)的修復(fù)和功能重建。

本研究采用以去垢劑和胰蛋白酶聯(lián)合的脫細(xì)胞方法制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)作為支架，以從犬骨髓分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮樣細(xì)胞作為種子細(xì)胞，并在搏動性生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的方法進(jìn)行構(gòu)建。

1 材料與方法

1.1 種子細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

1.1.1 犬的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng):取健康成年雜種犬，由北京市科宇實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖中心提供［SCXK(京)2000－0015，動物飼養(yǎng)級別 1 級］，雌雄不限，平均體質(zhì)量在(15±1.5)kg左右。速眠新II注射液和安定注射液1∶1混勻肌內(nèi)注射麻醉后。無菌條件下，以肝素預(yù)潤的16號骨穿針穿刺髂前上棘，抽取骨髓10 mL。加入肝素抗凝(每毫升骨髓加入肝素100 U)，以等體積的PBS充分混勻，4℃條件下轉(zhuǎn)入離心管中，取20 mL淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll，1.077 g/L，Sigma)，將稀釋骨髓按1∶1小心加在分離液的界面上。用水平離心機(jī)以1500 r/min離心30 min后，取中層云霧狀單個核細(xì)胞層，加PBS反復(fù)離心洗滌3次，每次2000 r/min離心5 min。將分離的單個核細(xì)胞按1×104/cm2密度接種于預(yù)先用明膠(0.2%)襯底的 25 cm2培養(yǎng)瓶，用含有 LG－DMEM和FBS(比例為9∶1)混勻培養(yǎng)液懸浮，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.1.2 犬的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞:將分離的骨髓單個核細(xì)胞分別按1×104/cm2密度接種于預(yù)先用明膠(0.2%)襯底的25 cm2培養(yǎng)瓶，內(nèi)皮樣細(xì)胞以內(nèi)皮樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液 EBM－2培養(yǎng)液(Lonza，包含 5% FBS、VEGF、hFGF－b、IGF－1、hEGF、hydrocortisone 和ascorbic acid)懸浮，平滑肌樣細(xì)胞以誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)液含 10%的胎牛血清、PDGF－BB 5 μg/L、TGF－β1 2 μg/L、IGF－1 5 μg/L、100 U/mL 青霉素、100 g/L鏈霉素)重懸，置于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48 h后輕輕換液棄去未貼壁細(xì)胞，以后每隔2 d更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長至80%～90%匯合時，以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液消化，傳代培養(yǎng)。每天倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征。

1.1.3 誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮樣細(xì)胞、平滑肌樣細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定:免疫熒光鑒定方法為把誘導(dǎo)的內(nèi)皮樣細(xì)胞、平滑肌樣細(xì)胞以1×104/cm2的密度接種于24孔板內(nèi)，隔日換液。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征。36 h待細(xì)胞達(dá)到完全貼附后進(jìn)行鑒定。內(nèi)皮樣細(xì)胞進(jìn)行 CD31和 VIII因子(1∶200)特異性抗體鑒定，平滑肌樣細(xì)胞則進(jìn)行 α－SMA(1∶400)、SMMHC(1∶500)特異性抗體鑒定。

1.2 脫細(xì)胞基質(zhì)的制備與檢測

1.2.1 脫細(xì)胞基質(zhì)的制備:脫細(xì)胞方法基于Kaushal等［2］所描述的方法，并對其進(jìn)行了部分改進(jìn)。具體為:將獲得的豬頸血管放在蒸餾水中1 h，以去除血液成分。然后將血管放入到含0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA(Sigma)中37℃恒溫水槽處理6 h，然后將血管放入到含有 1% Triton X－100(Sigma)和0.1%氨水的PBS中，放置于脫色搖床上(30 r/min)，4℃條件下振蕩處理72 h。每日更換脫細(xì)胞溶液。

1.2.2 組織學(xué)觀察:取新鮮的豬頸動脈和制備得到的血管脫細(xì)胞基質(zhì)，用4%甲醛固定，石蠟包埋后切片以進(jìn)行蘇木精－伊紅(HE)染色、Masson三色法檢測胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性。

脫細(xì)胞血管基質(zhì)，用2%戊二醛固定后，用無菌PBS沖洗3遍后，凍干抽真空。標(biāo)本送檢北京師范大學(xué)電鏡測試中心，進(jìn)行掃描電鏡檢查，觀察脫細(xì)胞基質(zhì)的脫細(xì)胞效果和孔徑大小。

1.2.3 爆破強(qiáng)度與縫合強(qiáng)度檢測:將脫細(xì)胞血管基質(zhì)標(biāo)本進(jìn)行移植前的力學(xué)性能檢測，包括爆破強(qiáng)度(burst strength)、縫合強(qiáng)度，并與正常豬的頸動脈進(jìn)行對照。

1.2.4 孔隙率檢測:新鮮豬頸動脈及脫細(xì)胞血管基質(zhì)標(biāo)本經(jīng)真空凍干后進(jìn)行孔隙率檢測?？紫堵蕼y定采用Autopore IV 9510壓汞儀，壓力范圍0.5～6000 Pa。測試樣本包括3組脫細(xì)胞血管和正常豬的頸動脈作為對照。

1.2.5 脫細(xì)胞基質(zhì)組織膠原含量測定:膠原是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要蛋白質(zhì)成份，約占機(jī)體總蛋白的 25%。羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)為非必需氨基酸，是構(gòu)成膠原組織主要成分，含量相對穩(wěn)定，約占膠原氨基酸總量的10%，是衡量組織膠原含量的特異性指標(biāo)之一［3］。因此，測定HYP的量能確定組織中膠原的含量。我們采用胃酶酸解法對脫細(xì)胞三組樣本(每組3個樣本)與自然正常豬的頸動脈(3個樣本)進(jìn)行了測試。

1.3 生物反應(yīng)器下脫細(xì)胞支架內(nèi)皮細(xì)胞的動態(tài)種植

將脫細(xì)胞支架材料用75%酒精浸泡1 h消毒后，用無菌PBS沖洗浸泡3遍，每次1 h，以去除消毒酒精。將消毒好的脫細(xì)胞支架置于無菌離心管內(nèi)，用EBM－2培養(yǎng)液浸泡12 h。將消化計數(shù)好的誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮細(xì)胞按照1×105/cm2的密度將細(xì)胞懸液注入到管狀支架的腔內(nèi)，兩端封閉。置入培養(yǎng)箱內(nèi)旋轉(zhuǎn)種植3 h，轉(zhuǎn)速為5～6 r/h。灌流液體選用EBM－2培養(yǎng)液，通過調(diào)節(jié)蠕動泵轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)流量，進(jìn)而調(diào)節(jié)反應(yīng)器的剪切力。采用逐漸增加剪切力的方式，1 d內(nèi)逐漸將剪切力由 1 dyn/cm2增加至 10 dyn/cm2，然后在10 dyn/cm2剪切力條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 d。同時以在脫細(xì)胞支架上靜態(tài)培養(yǎng)3 d的內(nèi)皮細(xì)胞的血管支架作為對照。標(biāo)本取材，留取 HE染色和掃描電鏡檢查樣本。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)分化種子細(xì)胞的結(jié)果

分離獲得的骨髓MSCs經(jīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)后，培養(yǎng)48 h，可見貼壁細(xì)胞呈集落樣生長，細(xì)胞呈長梭形、三角形、紡錘形或不規(guī)則形，核分裂相明顯。此后，細(xì)胞生長迅速，集落邊緣細(xì)胞呈紡錘形近似單層生長，集落中心則細(xì)胞密集呈復(fù)層生長。誘導(dǎo)內(nèi)皮樣細(xì)胞加EBM－2完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，牢固貼附在培養(yǎng)瓶底，初為圓形或橢圓形，多呈小團(tuán)集落存在，24 h后牢固貼附在培養(yǎng)瓶底。培養(yǎng)2～3 d細(xì)胞生長迅速，集落增大，并開始匯合形成排列較疏松的單細(xì)胞，此時細(xì)胞較大，有明顯的橢圓形核，常有2～5個核仁。6～8 d完全匯合形成連續(xù)的單層細(xì)胞，匯合成片后外觀呈“鵝卵石”樣形態(tài)。誘導(dǎo)的血管平滑肌樣細(xì)胞多數(shù)呈圓形。接種于培養(yǎng)瓶中約4 h貼壁，培養(yǎng)24 h后，可見細(xì)胞呈三角形或梭形，有少量突起;3 d細(xì)胞開始增殖;7 d左右細(xì)胞密集，呈峰谷樣生長。平滑肌細(xì)胞有一卵圓形或圓形明亮的核，核中有1～4個大小不一深色的核仁，細(xì)胞質(zhì)豐富，含少量顆粒。細(xì)胞逐漸伸展，透明度增高，周界不清，突起相互接觸，平等排列成束，密集與稀疏處相互交錯成“峰谷”狀。

內(nèi)皮樣細(xì)胞、平滑肌樣細(xì)胞的免疫熒光鑒定:內(nèi)皮樣細(xì)胞VIII因子，CD31染色陽性，著色位于細(xì)胞核周圍，誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮細(xì)胞呈陽性(圖1，彩插2);平滑肌樣細(xì)胞 α－actin、calponin及 SMMHC染色陽性(圖2見彩插2，圖3見彩插3)。

2.2 脫細(xì)胞支架

2.2.1 形態(tài):形態(tài)學(xué)觀察:豬頸動脈經(jīng)脫細(xì)胞處理后外觀呈乳白色，外表面呈微絨毛狀，管壁彈性良好無塌陷，管腔內(nèi)表面光滑。

2.2.2 脫細(xì)胞支架檢測:組織切片的HE染色結(jié)果表明，豬頸血管的細(xì)胞的破裂，支架中已經(jīng)沒有可見核染，細(xì)胞成分被完全清除。胰酶處理6 h，細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)有所破壞，內(nèi)彈力板部分?jǐn)嗔选ｋS后的Masson染色結(jié)果也表明，基質(zhì)中藍(lán)染的膠原纖維結(jié)構(gòu)完整，紅色的細(xì)胞成分基本被除，同時以自然豬的頸動脈作為對照進(jìn)行HE、Masson染色(圖4、5，彩插3)。掃描電鏡結(jié)果表明脫細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)膜面沒有內(nèi)皮細(xì)胞及其殘余成分，胰酶處理6 h，內(nèi)彈力板可見大小不等孔隙，橫切面可見脫細(xì)胞基質(zhì)為疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔徑最大平均為99.2 μm(圖6)。

圖6 脫細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)膜面(a)與側(cè)面掃描電鏡(b)Fig.6 SEM appearance of decellularized arterial matrix.a.The intimal surface;b.the lateral surface.

2.2.3 生物力學(xué)檢測:①爆破強(qiáng)度:為了了解自體活組織管是否具有足夠的強(qiáng)度能夠耐受生理的張力，我們進(jìn)行爆破強(qiáng)度檢測，以了解該材料破裂前所能承受的最大壓力。對5根脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行了測試，5根未處理的自然頸動脈作為對照。統(tǒng)計學(xué)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，與自然血管比較，脫細(xì)胞基質(zhì)爆破強(qiáng)度P值為 0.073(P＞0.05)，兩者爆破強(qiáng)度無統(tǒng)計學(xué)差異。②縫合耐受強(qiáng)度:每個標(biāo)本測試3次，對5根脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行了測試，5根未處理的自然頸動脈作為對照，每組結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩者的強(qiáng)度接近(P＞0.05)，提示本組活組織生物管具有足夠的可縫合強(qiáng)度，能夠耐受在體的端端吻合操作。見表1。

表1 脫細(xì)胞基質(zhì)和自然血管的力學(xué)與膠原含量測定比較(±s)Tab.1 Comparison of the mechanical properties and collagen content of decellularized arterial matrix and natural artery

表1 脫細(xì)胞基質(zhì)和自然血管的力學(xué)與膠原含量測定比較(±s)Tab.1 Comparison of the mechanical properties and collagen content of decellularized arterial matrix and natural artery

Collagen content脫細(xì)胞基質(zhì)(Decellularized arterial matrix)膠原含量(mg/g)(n=3)組別Group爆破強(qiáng)度(mmHg)(n=5)Bursting strength縫合強(qiáng)度(N)(n=5)Suture strength 1863±83 2.80±0.27 186±11自然血管(Natural carotid artery)1955±97 3.04±0.19 293±18

2.2.4 脫細(xì)胞基質(zhì)膠原含量測定:取脫細(xì)胞基質(zhì)3個樣本與自然血管3個樣本，進(jìn)行了組織動脈HYP(膠原)含量測定，從而計算出動脈支架的膠原含量數(shù)值［3］。膠原含量與自然血管均有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)。統(tǒng)計學(xué)分析，采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，與自然血管比較，脫細(xì)胞基質(zhì)爆破強(qiáng)度P值為0.073，縫合強(qiáng)度三組 P值為 0.064，二者均 P ＞0.05。膠原含量與自然血管均有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)。見表1。

2.2.5 孔隙率的檢測:自然血管的孔隙率為64.2%，脫細(xì)胞基質(zhì)的孔隙率為94.93%。

2.3 反應(yīng)器下組織工程血管構(gòu)建

血管脫細(xì)胞基質(zhì)旋轉(zhuǎn)種植3 h后反應(yīng)器動態(tài)培養(yǎng)3 d，HE染色可見脫細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)表面整齊排列一層有核細(xì)胞形態(tài)(圖7，彩插3);掃描電鏡結(jié)果可見基質(zhì)的管腔面基本為種植的EC覆蓋，部分細(xì)胞伸展入基質(zhì)內(nèi)彈力層，細(xì)胞伸展，排列方向與培養(yǎng)液流動方向一致。相同密度的內(nèi)皮細(xì)胞靜態(tài)種植3 d后的掃描電鏡可見細(xì)胞貼附在基質(zhì)的管腔面生長，成片狀，細(xì)胞排列雜亂(圖8)。

圖8 靜態(tài)種植(a)與(b)體外構(gòu)建內(nèi)膜面掃描電鏡Fig.8 SEM appearance of the inner surface of the grafts.a.static cultivation;b.in vitro construction

3 討論

隨著各種直徑大小的血管移植物在胸心外科手術(shù)中的應(yīng)用，血管移植物的研究成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前對小口徑血管移植替代物臨床需要很大，但可供使用的小口徑替代物又十分缺乏，因此研制一種優(yōu)良的小口徑血管替代品就顯得特別迫切［4］。

組織工程學(xué)是近年來研究的一個熱點(diǎn)領(lǐng)域［5］，有望解決臨床小口徑移植物短缺的問題［4］。血管組織工程研究的主要內(nèi)容集中在三個方面:① 種子細(xì)胞的培養(yǎng)與生長;② ECM替代物;③組織工程血管三維培養(yǎng)技術(shù)的研究。

血管組織工程所應(yīng)用的種子細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋于血管的內(nèi)表面，呈單層排列，并能分泌多種血管活性因子如內(nèi)皮素、前列腺素、一氧化氮(NO)等，具有抑制血小板聚集、抗血栓形成及抗內(nèi)膜增生的作用［6］，從而保持血管的穩(wěn)定性。雖然自體來源的血管細(xì)胞獲取和培養(yǎng)技術(shù)都已經(jīng)較為完善，但是限于個體差異，并非所有患者都有合適的自體靜脈可供選擇，獲取的細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞活力也因人而異。最主要的問題是體外培養(yǎng)和構(gòu)建的時間過長，難以滿足急癥患者的需要。并且患者如果并存有動脈硬化或糖尿病時，往往自體來源的內(nèi)皮細(xì)胞存在功能低下的問題，其分裂增殖的能力和分泌細(xì)胞因子的能力均下降［7］。

間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cell，MSC)是組織中多能干細(xì)胞的混合體，具有來源廣泛、取材方便、分化較容易、可分化的組織類型廣泛等優(yōu)點(diǎn)，因而在組織工程方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)的方法，成功誘導(dǎo)分離了犬的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并進(jìn)行了傳代培養(yǎng)。內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 EBM－2完全培養(yǎng)基，平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基是含有 PDGF－BB，TGF－β1，IGF－1特定誘導(dǎo)培養(yǎng)基，成功誘導(dǎo)分化成內(nèi)皮樣細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞，并表現(xiàn)了其特有的細(xì)胞形態(tài)。誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮細(xì)胞樣細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞樣細(xì)胞經(jīng)過特定的細(xì)胞鑒定，CD31和VIII因子在誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞樣細(xì)胞均呈明顯陽性表達(dá)，α－SMA、calponin和SM－MHC在誘導(dǎo)的SMCs的也呈明顯陽性表達(dá)。

ECM的研究仍是目前研究的重點(diǎn)。脫細(xì)胞的異種或同種異體的血管作為小口徑組織工程血管具有以下優(yōu)點(diǎn):①生物來源的材料，生物相容性大大提高;②可生物降解性，允許受者自身組織的重建:③細(xì)胞成分被除去，免疫原性大大降低，炎癥反應(yīng)發(fā)生的幾率也大大降低;④胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)保持完整，機(jī)械強(qiáng)度較高，同時脫細(xì)胞基質(zhì)相當(dāng)于合成材料有利于細(xì)胞的生長［8］。

本研究采用Kaushal 2001年Nature雜志發(fā)表論文的脫細(xì)胞基本方法選用酶消化法和非離子去垢劑聯(lián)合處理，對豬的頸動脈進(jìn)行脫細(xì)胞處理［3］。傳統(tǒng)的胰酶處理1 h，Triton X－100和氨水處理72 h，此方法我們發(fā)現(xiàn)，脫細(xì)胞效果明確，ECM完整，但是獲得的脫細(xì)胞基質(zhì)的孔徑與孔隙率不足，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胰酶處理1 h，其孔隙率為65%，孔徑為54 μm，無法滿足種子細(xì)胞種植(尤其是平滑肌細(xì)胞種植)的要求。我們采取了不同的探索，如何在保障脫細(xì)胞基質(zhì)適當(dāng)力學(xué)強(qiáng)度的前提下，盡量增大脫細(xì)胞基質(zhì)的孔徑。最后我們選擇胰酶處理6 h作為時間切入點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)觀察，ECM中無細(xì)胞成分，脫細(xì)胞的支架結(jié)構(gòu)基本完整，組織學(xué)切片觀察，內(nèi)彈力板部分破壞，掃描電鏡檢測可見內(nèi)彈力膜有大小不等的孔洞，獲得的ECM的最大孔徑99.2 μm，孔隙率是94.93%。雖然脫細(xì)胞基質(zhì)的膠原含量有所下降，但隨后生物力學(xué)檢測，其縫合強(qiáng)度與爆破強(qiáng)度相對于自然血管雖略有降低，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異。

在血管生長發(fā)育過程中，血流動力起重要作用［9，10］。合適的切應(yīng)力環(huán)境有利于血管平滑肌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化，過高切應(yīng)力則會抑制其生長［11，12］。構(gòu)建組織工程血管的一大難題在于血管處在一個天然的機(jī)械動力環(huán)境，它包括:血液流經(jīng)內(nèi)皮層的切線產(chǎn)生的切變應(yīng)力，環(huán)形管壁舒縮產(chǎn)生的牽張應(yīng)力和靜水壓產(chǎn)生的正常應(yīng)力。切變應(yīng)力對血管細(xì)胞的形態(tài)、增殖、極性及基質(zhì)的構(gòu)成和結(jié)構(gòu)有重要的影響。目前用于血管組織工程的生物反應(yīng)器的研制主要是通過模擬體內(nèi)的血流動力學(xué)條件，旨在體外培育成在結(jié)構(gòu)和功能上與天然血管具有相同作用的人工血管。

本實(shí)驗(yàn)采用將犬骨髓分離培養(yǎng)的MSCs誘導(dǎo)分化的ECs為種子細(xì)胞，以豬脫細(xì)胞血管基質(zhì)為支架，將 ECs旋轉(zhuǎn)種植到脫細(xì)胞基質(zhì)上，并在模擬血管的搏動性生物反應(yīng)器內(nèi)在剪切力的條件下培養(yǎng)，低剪切力條件下完成了小口徑組織工程血管構(gòu)建，實(shí)驗(yàn)剪切力的條件，發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)器早期，如果過快增加剪切力，不利于內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。所以我們采用逐漸增加剪切力的方式，1 d內(nèi)逐漸將剪切力由1 dyn/cm2增加至10 dyn/cm2，然后在 10 dyn/cm2剪切力條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 d。從構(gòu)建后血管與未進(jìn)行反應(yīng)器種植僅僅內(nèi)皮細(xì)胞粘附的血管基質(zhì)比較，HE染色與掃描電鏡觀察，動態(tài)反應(yīng)器下血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附較好，細(xì)胞平鋪整齊，細(xì)胞沿著血流方向生長。

本項(xiàng)研究表明小口徑組織工程血管移植物可以通過將MSCs誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞，以脫細(xì)胞血管支架作為基質(zhì)，在搏動性生物反應(yīng)器內(nèi)，通過逐漸增加剪切力條件的方法，成功進(jìn)行體外組織工程小口徑血管的構(gòu)建。

(本文圖 1、2見彩插 2，圖 3－5、7見彩插 3)

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Preliminary Study of in vitro Construction of Small-Diameter Vascular Graft by Seeding Cells onto Decellullarized Arterial Matrix

WU Xin，GU Yong－quan，DUAN Hong－yong，CHEN Bing，LI Jian－xin，WU Ying－feng，ZHANG Shu－wen，WANG Zhong－gao，ZHANG Jian
Department of Vascular Surgery，Xuan Wu Hospital，Capital University of Medical Sciences，Beijing 100053，China

ObjectiveTo explore the use of canine bone marrow mesenchyme stem cells to induce differentiated seed cells in vitro，and using the seeding cells to develop small－diameter vascular graft based on xenogenic decellularized arterial matrix.MethodsCanine bone marrow mesenchymal stem cells were separated by density gradient centrifugation and cultured in vitro，and differentiated into endothelial cells and smooth muscle cells.Porcine carotid arteries were decellularized using Triton X－100 and tripsin to eliminate all the cellular components.The mechanical and biocompatibility properties of the decellularized scaffolds were identified and evaluated.Small－diameter tissue engineered vascular grafts were constructed using the decellularized scaffolds and seeding cells in the dynamic bioreactor under dynamic conditions.ResultsThe cultured bone marrow mesenchymal stem cells were successfully differentiated into endothelial－like cells and smooth muscle－like cells，which can be used as seeding cells.Porcine carotid arteries were successfully decellularized by trypsin，ammonium hydroxide and non－ionic detergent eliminating all cellular components to make acellular scaffolds.Good pore size and porosity of the acellular scaffold were obtained.The biomechanics，immunogenicity and cell compatibility characteristics of the scaffolds could meet the requirements of tissue engineered vascular graft.Therefore，construction of the tissue engineered vascular graft in vitro in the dynamic bioreactor was succeded.ConclusionsBone marrow mesenchyme stem cells can be induced to differentiated into endothelial－like cells and smooth muscle－like cells in vitro.Using these cells as seeding cells and xenogenic decellularized arterial matrix as acellular scaffolds，small－diameter vasculargrafts can be constructed in a pulsatile bioreactor by culture under dynamic conditions in vitro.

Bone marrow mesenchymal stem cells;Decellularization;Scaffold;Bioreactor;Vascular graft，tissue engineered;Arterial matrix;Dog

圖3 誘導(dǎo)的平滑肌樣細(xì)胞重鏈免疫熒光染色呈陽性Fig.3 SMMHC-positive smooth muscle-like cells, immunofluorescence staining

圖4 自然動脈(a)與脫細(xì)胞基質(zhì)(b)HE 染色Fig.4 Natural carotid artery (a) and decellularized arterial matrix (b), HE staining

圖5 自然動脈(a)與脫細(xì)胞基質(zhì)(b)Masson 染色Fig.5 Natural carotid artery (a) and decellularized arterial matrix (b), Masson staining

圖7 體外構(gòu)建小口徑血管(HE)Fig.7 An in vitro constructed small caliber tissue engineered vascular graft, HE staining

Q95－3，R654.3

A

1005－4847(2010)05－0377－06

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.05.004

2010－04－22

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)項(xiàng)目(2006AA02A134);北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號:5082007和2103049)資助。

武欣(1975－)，男，主治醫(yī)師，博士，主要從事血管外科的臨床與基礎(chǔ)研究。