杜 凱，孫 玉 梅，曹 方，王 珊，王 瀟 磊

（大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引言

脂肪酶（EC 3.1.1.3）是一類能催化酯類水解、合成或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的酶類。由于其催化的酯合成和轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)常在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行，因此存在酶易結(jié)塊、不易回收、很難重復(fù)利用等問(wèn)題。固定化技術(shù)不僅解決了上述問(wèn)題，而且提高了酶催化劑的穩(wěn)定性和活力［1-3］。目前，對(duì)吸附固定化載體的研究主要集中在多孔和大孔材料上［4-6］，其中，活性炭顆粒具有無(wú)毒、強(qiáng)度好、價(jià)格低廉、固定化操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，具有實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。有報(bào)道以活性炭和硅膠顆粒為載體吸附固定化菠蘿酶，在相同的條件下，干燥后的活性炭吸附酶相對(duì)活力為46.7%，是硅膠吸附酶相對(duì)活力的1.64倍［7］。王海雄等［8］以活性炭為載體，在pH 8.0的條件下吸附豬胰脂酶，未干燥的固定化酶活力與等量的游離酶相比提高了10%。本文以不同粒度的活性炭吸附固定脂肪酶，考察載體粒度和吸附條件對(duì)脂肪酶固定化的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

LVK-F100脂肪酶，12 000U/g，深圳市綠維康生物工程有限公司；20、40、60目活性炭，沈陽(yáng)市 新 西 試 劑 廠；0.05 mol/L 磷酸緩沖液（K2HPO3-KH2PO3）；其他試劑均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 活性炭顆粒的預(yù)處理

將一定量不同粒度活性炭顆粒分別置于1mol/L HCl溶液中，于50 ℃、100r/min 攪 拌1h后除去酸液，用去離子水反復(fù)沖洗至洗液pH為中性，然后置于130 ℃烘箱中烘干待用。

1.2.2 酶液的制備

分別取15g 酶粉溶于300 mL、不同pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的磷酸緩沖液，于室溫、300r/min攪拌2h后4 000r/min離心10min，上清液即為質(zhì)量濃度0.1mg/mL 的酶液。再用與上清液pH 相同的磷酸緩沖液稀釋上清液，制得不同pH 條件下質(zhì)量濃度分別為0.01、0.03、0.05、0.07mg/mL的酶液。

1.2.3 時(shí)間及活性炭粒度對(duì)脂肪酶固定化的影響

分別將1g 不同粒度活性炭加入到30 mL 0.05mg/mL、pH 7.0 的酶液中，于30 ℃、150r/min振蕩吸附1、2、3、4、5h 后，室溫干燥24h。

1.2.4 酶液質(zhì)量濃度對(duì)脂肪酶固定化的影響

分別將1g不同粒度活性炭加入30mL pH 7.0、不同質(zhì)量濃度（0.01、0.03、0.05、0.07mg/mL）的酶液中，于30 ℃、150r/min 振蕩吸附1h后，室溫干燥24h。

1.2.5 酶液pH 值對(duì)脂肪酶固定化的影響

分別將1g 不同粒度活性炭加入30 mL 0.05mg/mL不同pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的酶液中，于30 ℃、150r/min振蕩吸附1h后，室溫干燥24h。

1.2.6 溫度對(duì)脂肪酶固定化的影響

分別將1g 不同粒度活性炭加入到30 mL 0.05mg/mL、pH 7.0 的酶液中，于不同溫度（20、25、30、35、40 ℃）、150r/min 振蕩吸附1h后，室溫干燥24h。

1.2.7 蛋白含量測(cè)定

采用Bradford法［9］，使用牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.8 固定化酶活力測(cè)定

采用改進(jìn)的橄欖油乳化法［10］。稱取一定量的橄欖油和聚乙二醇，加入適量pH 7.0的磷酸緩沖液配制成乳化液，并于48 ℃預(yù)熱5min后加入待測(cè)的固定化脂肪酶，于48 ℃恒溫?cái)嚢?0min，用10mL 95%的乙醇終止反應(yīng)。再以酚酞為指示劑，用0.025mol/L 的NaOH 滴定水解產(chǎn)生的脂肪酸。

酶活力定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1μmol脂肪酸所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U）。

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次平行測(cè)定的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 活性炭粒度對(duì)脂肪酶固定化的影響

不同吸附時(shí)間內(nèi)，不同粒度載體的吸附酶量及其固定化酶活力如圖1、2所示。

圖1 活性炭粒度和吸附時(shí)間對(duì)吸附酶量的影響Fig.1 Effect of particle sizes of carbon active and time on lipase adsorption

圖2 活性炭粒度和吸附時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響Fig.2 Effect of particle sizes of carbon active and time on immobilized lipase activity

在吸附1h時(shí)，活性炭粒度越小其吸附酶量越大，不同粒度固定化酶表現(xiàn)出了較高且相近的酶活力。隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，不同粒度活性炭的吸附酶量均有少量增加，而固定化酶活力卻呈下降趨勢(shì)，這與Park 等［11］的研究現(xiàn)象與結(jié)果相同。Park等在研究硅膠顆粒對(duì)固定化酶催化脂肪酸甲酯化反應(yīng)的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，載體粒度越小，其比表面積越大；隨著載體表面吸附酶量的增加，酶分子之間產(chǎn)生凝結(jié)作用的機(jī)會(huì)增多，易形成多層包被或皺褶結(jié)構(gòu)。此結(jié)構(gòu)形成的空間位阻，阻礙了底物與酶的接觸，同時(shí)也阻礙了反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散。

2.2 酶液質(zhì)量濃度對(duì)脂肪酶固定化的影響

在改變酶液質(zhì)量濃度的情況下吸附固定化脂肪酶，不同粒度載體的吸附酶量及其固定化酶的活力如圖3、4所示。

圖3 酶液質(zhì)量濃度對(duì)吸附酶量的影響Fig.3 Effect of concentration of lipase solution on lipase adsorption

圖4 酶液質(zhì)量濃度對(duì)固定化酶活力的影響Fig.4 Effect of concentration of lipase solution on immobilized lipase activity

由圖3、4可見(jiàn)，增大酶液質(zhì)量濃度有利于載體吸附酶量的增加。在酶液質(zhì)量濃度為0.05mg/mL時(shí)，不同粒度固定化酶的活力最大；當(dāng)酶液質(zhì)量濃度增大到0.07mg/mL 時(shí)，固定化酶活力明顯下降。這是由于過(guò)高的酶液質(zhì)量濃度使載體負(fù)載的酶量過(guò)大，脂肪酶分子在載體表面已形成多層包被或褶皺結(jié)構(gòu)。此外，與其他粒度活性炭相比，40目活性炭的表面及孔徑結(jié)構(gòu)適中，使得固定化酶能在較寬的酶液質(zhì)量濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的活力。

2.3 酶液pH 對(duì)脂肪酶固定化的影響

在改變酶液pH 的情況下吸附固定化脂肪酶，不同粒度載體的吸附酶量及其固定化酶活力如圖5、6所示。

圖5 酶液pH 對(duì)吸附酶量的影響Fig.5 Effect of lipase solution pH on lipase adsorption

圖6 酶液pH 對(duì)固定化酶活力的影響Fig.6 Effect of lipase solution pH on immobilized lipase activity

由圖5、6可知，酶液pH 對(duì)不同粒度載體吸附酶量無(wú)顯著影響，卻對(duì)固定化酶活力影響顯著。當(dāng)pH 為7.0 時(shí)，固定化酶活力最高，與LVKF100游離脂肪酶的最適pH 相同。不同的酶液pH 會(huì)改變酶分子和載體的離子化狀態(tài)，并且脂肪酶分子對(duì)pH 有“記憶”效應(yīng)，即脂肪酶分子會(huì)“記憶”其吸附pH 下的離子化狀態(tài)和分子構(gòu)象。酶經(jīng)過(guò)固定化后，離子化狀態(tài)和分子結(jié)構(gòu)不會(huì)因?yàn)榉磻?yīng)體系pH 的變化而改變［12］。另外，固定化酶的干燥過(guò)程會(huì)使酶周圍環(huán)境的pH 上升，使酶蛋白發(fā)生堿催化的β-消除反應(yīng)，部分胱氨酸被降解導(dǎo)致酶部分失活。因此偏酸性酶液對(duì)固定化酶活力的影響較偏堿性酶液小［13］。

2.4 溫度對(duì)脂肪酶固定化的影響

在改變吸附溫度的情況下吸附固定化脂肪酶，不同粒度載體的吸附酶量及其固定化酶活力如圖7、8所示。

圖7 溫度對(duì)吸附酶量的影響Fig.7 Effect of temperature on adsorption

圖8 溫度對(duì)固定化酶活力的影響Fig.8 Effect of temperature on immobilized lipase activity

溫度的變化對(duì)活性炭吸附酶量無(wú)顯著影響。在30 ℃時(shí)，3種固定化酶活力最高。溫度影響脂肪酶分子的熱運(yùn)動(dòng)，低溫導(dǎo)致脂肪酶分子在活性炭表面分布效果差，影響底物與酶分子的結(jié)合與釋放。溫度過(guò)高則會(huì)破壞酶蛋白側(cè)鏈的相互作用，從而破壞酶的空間構(gòu)象，導(dǎo)致酶活力下降甚至失活［14］。

3 結(jié)論

固定化脂肪酶活力受載體吸附酶量和固定化后脂肪酶構(gòu)象的影響。載體粒度和酶液質(zhì)量濃度影響載體吸附酶量，載體粒度越小，比表面積越大、表面孔隙越多，能夠提供的結(jié)合位點(diǎn)越多，而適當(dāng)?shù)拿敢簼舛饶芙档兔阜肿幽?。酶液pH 和溫度影響脂肪酶分子的空間構(gòu)象，高溫會(huì)破壞酶蛋白的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，pH 過(guò)高則會(huì)使酶蛋白發(fā)生堿催化的β-消除反應(yīng)，導(dǎo)致酶部分失活。