陳 雅 欣，黃 燕，單 婷 婷，富 瑤 瑤，蘆 明 春，魚 紅 閃，金 鳳 燮

（大連工業(yè)大學 生物與食品工程學院，遼寧 大連 116034）

0 引言

納豆是日本常見的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，由黃豆通過納豆菌（枯草桿菌）發(fā)酵制成。納豆中的大豆異黃酮具有降血壓、抗腫瘤、抗氧化性、溶血栓等作用［1］。大豆異黃酮是一種植物雌性激素，共有12種不同結(jié)構(gòu)，其中有9種結(jié)合型糖苷和3種游離型苷元［2］。大豆異黃酮一般情況下以糖結(jié)合的苷類形式存在，主要為染料木苷和大豆苷，約占總量的97%～98%，而游離型的苷元僅占2%～3%［3］。糖苷須在大豆異黃酮糖苷水解酶作用下轉(zhuǎn)化成游離的苷元形式才能發(fā)揮抗癌、抗氧化等相應的生物學功能，其作用是未水解前糖苷的30倍。大豆異黃酮因其明顯的生物學活性引起學術(shù)界的普遍關(guān)注，但和納豆制品相結(jié)合的報道相對較少，這對得到高品質(zhì)的保健食品具有實際意義。王莉等［4］曾用菌種Bacillusnatto918研究了納豆發(fā)酵過程中大豆異黃酮的變化。本文以得到大豆異黃酮苷元含量高的納豆制品為目的，采用古法制備納豆，從中分離出高活性的納豆菌。進行發(fā)酵，從發(fā)酵液中提取了大豆異黃酮，考察了在不同時間、pH、含水質(zhì)量分數(shù)、溫度下大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為大豆異黃酮苷元的情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采用日本古法制備納豆，以從制備納豆中篩選出的納豆菌為實驗菌種。薄層層析板Kiesel gel 60F254，德國Merck公司。

培養(yǎng)基：配制100g 培養(yǎng)基，分別稱取蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、葡萄糖、NaCl各0.5g，瓊脂2g，調(diào)節(jié)pH 7.5，121 ℃滅菌20min。

1.2 實驗方法

1.2.1 納豆的制備

稱取適量經(jīng)冷去離子水浸泡24h的稻草平鋪于大燒杯內(nèi)，將適量蒸煮過20min的黃豆平鋪于稻草之上，最后在黃豆上再平鋪一層上述經(jīng)冷去離子水浸泡過的遼陽稻草，置于37℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)24～48h。

1.2.2 菌種的篩選

無菌條件下稱取適量制備好的納豆，加入10倍體積的質(zhì)量分數(shù)為0.7%的NaCl，攪拌均勻后采用0.7% NaCl對其進行梯度稀釋，梯度分別為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，將稀釋菌液分別涂布于培養(yǎng)基上，于37℃進行恒溫培養(yǎng)。待長出菌體后，選擇長有較多單個菌落的稀釋度的平板，進行斜面培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)接種量為1 環(huán)，于37 ℃進行擴大培養(yǎng)。

1.2.3 大豆異黃酮的提取與測定［5-7］

將采用古法制備的納豆中加入6 倍體積的80%乙醇在70 ℃浸提3h，浸提液經(jīng)冷卻離心（4 ℃，5 000r/min，5min），所得上清液即為大豆異黃酮粗提物。采用TLC 檢測，點樣量為5μL，展開劑為乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水（體積比為10∶7∶1∶1），于254nm 下觀測斑點，確定大豆異黃酮苷的轉(zhuǎn)化情況。

1.2.4 納豆制備條件的選擇

培養(yǎng)時間的選擇：將接入納豆菌的大豆，置于37 ℃培養(yǎng)，pH 為7.0，含水質(zhì)量分數(shù)為60%，接菌量3mL，發(fā)酵時間分別選擇24、48、72、96h，確定最佳培養(yǎng)時間。

培養(yǎng)溫度的選擇：將接入納豆菌的大豆，分別置于34、37、40、44 ℃發(fā)酵培養(yǎng)，pH 為7.0，含水質(zhì)量分數(shù)60%，接菌量3mL，培養(yǎng)48h，確定最佳培養(yǎng)溫度。

pH 的選擇：將接入納豆菌的大豆，置于37 ℃培養(yǎng)，含水質(zhì)量分數(shù)60%，接菌量3 mL 時培養(yǎng)48h，調(diào)發(fā)酵pH 分別為5.0、6.0、7.0、8.0，確定最佳培養(yǎng)pH 值。

含水質(zhì)量分數(shù)的選擇：將接入納豆菌的大豆，置于37 ℃培養(yǎng)，pH 為7.0，接菌量3mL 時培養(yǎng)48h，培養(yǎng)時含水質(zhì)量分數(shù)分別選擇40%、50%、60%、70%，確定最佳培養(yǎng)含水質(zhì)量分數(shù)。

接菌量的選擇：將接入納豆菌的大豆，置于37 ℃培養(yǎng)，pH 為7.0，含水質(zhì)量分數(shù)60%，培養(yǎng)48h，接菌量分別選擇1、2、3、4 mL，確定最佳培養(yǎng)接菌量。

2 結(jié)果與討論

2.1 古法制備納豆中菌種的篩選

如圖1所示，在稀釋度為10-5的培養(yǎng)基中出現(xiàn)較多單個菌落，因此選擇該培養(yǎng)基中的菌落作為實驗菌株，對其進行擴大培養(yǎng)。

圖1 納豆菌的菌落形態(tài)Fig.1 The shape of the natto strain

2.2 發(fā)酵條件對大豆異黃酮轉(zhuǎn)化的影響

為研究古法制備納豆過程中，各因素對大豆異黃酮轉(zhuǎn)化的影響，考察了不同的發(fā)酵條件下（培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、接菌量、pH、含水質(zhì)量分數(shù)）大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化情況。采用薄層層析法檢測。

2.2.1 培養(yǎng)溫度的選擇

如圖2所示，發(fā)酵后染料木苷、大豆苷等其他帶糖基的大豆異黃酮轉(zhuǎn)化成相應的苷元。在37 ℃發(fā)酵條件下進行培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于其他溫度。

圖2 培養(yǎng)溫度對大豆異黃酮轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on soybean isoflavone

2.2.2 培養(yǎng)時間的選擇

如圖3所示，24、72和96h培養(yǎng)的糖苷轉(zhuǎn)化為苷元的轉(zhuǎn)化率相差不大，但48h 明顯優(yōu)于三者，轉(zhuǎn)化效果較好。

圖3 培養(yǎng)時間對大豆異黃酮轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 Effect of fermentation time on soybean isoflavone

2.2.3 接菌量的選擇

如圖4所示，隨著接菌量的增加，大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化效果逐漸明顯。當接菌量達到3 mL 時，染料木苷、大豆苷的轉(zhuǎn)化率最高，所以選擇3mL為最佳接菌量。

圖4 接菌量對大豆異黃酮轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 Effect of inoculation volume on soybean isoflavone

2.2.4 pH 的選擇

如圖5所示，pH 為7.0 時大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化成苷元的效果較明顯，可以選為最適pH。

圖5 pH 對大豆異黃酮轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 Effect of pH on soybean isoflavone

2.2.5 含水質(zhì)量分數(shù)的選擇

如圖6所示，大豆異黃酮苷轉(zhuǎn)化成苷元的量隨含水質(zhì)量分數(shù)的增加而增大，在含水質(zhì)量分數(shù)為60%轉(zhuǎn)化率最大，含水質(zhì)量分數(shù)為70%反而減少，因此選擇60%為最佳含水質(zhì)量分數(shù)進行培養(yǎng)。

圖6 含水質(zhì)量分數(shù)對大豆異黃酮轉(zhuǎn)化的影響Fig.6 Effect of the water content on soybean isoflavone

3 結(jié)論

本文以得到大豆異黃酮苷元含量高的納豆制品為目的，采用日本古法制備納豆，以制備的納豆中分離的納豆菌作為出發(fā)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)納豆，以大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為大豆異黃酮苷元的效果為考察因素，確定出最適的發(fā)酵條件：培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時間48h、接菌量3 mL、pH 7.0、含水質(zhì)量分數(shù)60%。在此最適發(fā)酵條件下，大部分大豆異黃酮苷轉(zhuǎn)化為大豆異黃酮苷元。目前，市場上出售的大豆異黃酮中有97%為帶糖基的糖苷型，水解轉(zhuǎn)化成游離型的苷元能發(fā)揮更高的生理活性功能。