張 熹，祖 國(guó) 仁，陳 莉，劉 陽

（大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引言

生物活性多糖因其具有調(diào)節(jié)人體生理功能與增強(qiáng)免疫力的作用，而成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外科學(xué)研究的熱點(diǎn)課題［1-3］。海洋微生物所處的高鹽、高壓、低溫、寡營(yíng)養(yǎng)的特殊環(huán)境使其遺傳及生理特性與陸地微生物有所不同，賦予其獨(dú)特的生化結(jié)構(gòu)和生存機(jī)制，是開發(fā)新型多糖類免疫調(diào)節(jié)劑的重要資源［4］。海洋微生物胞外多糖是海洋微生物在生長(zhǎng)代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的多糖或多糖復(fù)合物，以適應(yīng)其生存環(huán)境，維持生命活動(dòng)。這類多糖大多是由多種單糖按照一定比例組成的雜多糖，其中葡萄糖、半乳糖和甘露糖最為常見；另外還含有葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基糖和丙酮酸等［5］。海洋微生物胞外多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、清除自由基和抗氧化等活性［6］。本文主要對(duì)1株海洋細(xì)菌產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件進(jìn)行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

海洋細(xì)菌B1109，從大連金石灘涼水灣海區(qū)潮間帶海泥中分離得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏1 g/L，蒸餾水400 mL/L，陳海水600mL/L。

種子培養(yǎng)基：同發(fā)酵培養(yǎng)基。

試管斜面培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基加入瓊脂20g/L。

1.1.3 儀 器

ZHWY-2102C空氣恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；YXQ-SG46-280SA 手提式高壓消毒器，上海市醫(yī)療儀器廠；TGL-16G 高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；722 型分光光度計(jì)，上海分析儀器廠；ZPS-250智能生化培養(yǎng)箱，黑龍江東拓儀器制造有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 測(cè)定方法

生物量測(cè)定：取定量的菌體培養(yǎng)液，稀釋一定的倍數(shù)后，用722分光光度計(jì)在600nm 下測(cè)定OD 值，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照。

多糖的測(cè)定：取定量發(fā)酵液于3 000r/min離心20 min，取上清液，加3 倍95%乙醇沉降，4 ℃冰箱內(nèi)保存。再次離心后將沉淀溶于水，加1倍氯仿正丁醇混合溶液離心去蛋白，取上清液，加3倍95%乙醇，冰箱沉降。將沉淀溶于一定量的水，苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖［7］。

1.2.2 培養(yǎng)條件

海洋細(xì)菌B1109菌株活化。取1～2環(huán)海洋細(xì)菌B1109接入種子培養(yǎng)基，28 ℃，200r/min搖床震蕩培養(yǎng)24h。將其取一定量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的100mL的三角瓶中，28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間，按方法“1.2.1”測(cè)定碳源、氮源及不同培養(yǎng)條件對(duì)海洋細(xì)菌B1109 產(chǎn)胞外多糖的影響，并以培養(yǎng)基裝量、溫度、接種量和培養(yǎng)基初始pH 培養(yǎng)條件為實(shí)驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)3 個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，綜合考察培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)胞外多糖的影響，見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 The table of orthogonal experiment factor horizontal

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

選取培養(yǎng)基裝量300 mL/L 三角瓶，種子接入量2%（相對(duì)培養(yǎng)基裝量），培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)基初始pH 自然。改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、牛肉膏和甘露醇），按實(shí)驗(yàn)方法“1.2.2”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定胞外多糖，結(jié)果見圖1。

圖1 碳源對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.1 Effect of carbon sources on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

碳源是菌株生長(zhǎng)過程中為菌株提高碳素來源的物質(zhì)，菌株的生長(zhǎng)及多糖的積累均受碳源的種類和加入量的影響。菌株利用碳源是具有選擇性的，糖類一般是良好的碳源和能源物質(zhì)，但菌株對(duì)不同糖類物質(zhì)的利用也有差別。從圖1可見，以麥芽糖、葡萄糖甚至蔗糖作為碳源，海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖都相對(duì)較高，考慮工業(yè)葡萄糖來源廣泛且價(jià)格便宜，本研究以葡萄糖作為產(chǎn)糖的碳源。

2.2 氮源對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

按上述同樣培養(yǎng)條件，以葡萄糖為碳源，改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源（蛋白胨、玉米漿、干酪素、硫酸銨、氯化銨和硝酸鈉），按實(shí)驗(yàn)方法“1.2.2”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定胞外多糖，結(jié)果見圖2。

圖2 氮源對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

氮源是菌株生長(zhǎng)另一個(gè)重要元素，氮源的有無，菌株利用的好壞直接影響菌株的生長(zhǎng)，從而影響菌株對(duì)多糖的積累。從圖2可見，以硫酸銨為氮源，海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖效果最好。

2.3 碳、氮質(zhì)量濃度對(duì)海洋細(xì)菌B1109 產(chǎn)胞外多糖的影響

按上述同樣培養(yǎng)條件，以葡萄糖、硫酸銨為碳源和氮源，選取發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 和60g/L，按實(shí)驗(yàn)方法“1.2.2”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定胞外多糖，再以確定的最佳碳源質(zhì)量濃度，選取氮源質(zhì)量濃度分別為2、3、4、5、6和7g/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3、4。

圖3 碳源質(zhì)量濃度對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.3 Effect of carbon content on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

圖4 氮源質(zhì)量濃度對(duì)海洋細(xì)菌B1109 產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.4 Effect of nitrogen content on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

碳、氮是微生物菌株生長(zhǎng)不可缺少的2種元素，同時(shí)二者在培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度也直接影響著菌株的生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)物的合成。質(zhì)量濃度過低則不能滿足菌株生長(zhǎng)的需要，質(zhì)量濃度過高也會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)。只有在較適合濃度時(shí)，才能促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)，并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。從圖3 和圖4可見，葡萄糖質(zhì)量濃度為20g/L，硫酸銨質(zhì)量濃度為4g/L時(shí)，海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖效果最好。

2.4 培養(yǎng)條件對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

2.4.1 培養(yǎng)基初始pH 對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

選取發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源為葡萄糖和硫酸銨，質(zhì)量濃度分別為20和4g/L，培養(yǎng)條件同上，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，按實(shí)驗(yàn)方法“1.2.2”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定胞外多糖，結(jié)果如圖5所示。

圖5 培養(yǎng)基初始pH 對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.5 Effect of culture medium initial pH on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

不同微生物菌株其生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物積累的pH 要求是不同的，從圖5可見，海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖較佳pH 7.0～8.0，中性偏堿性，以培養(yǎng)基初始pH 8.0為最佳。

2.4.2 培養(yǎng)基裝量對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

培養(yǎng)條件同上，確定培養(yǎng)基初始pH 為8.0，分別在100 mL 三角瓶中裝入20、30、40、50、60和70mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)方法“1.2.2”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定胞外多糖，結(jié)果如圖6所示。

圖6 培養(yǎng)基裝量對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.6 Effect of culture medium volume on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

在確定的搖床轉(zhuǎn)數(shù)下，培養(yǎng)基裝量多少實(shí)際反映的是微生物菌株對(duì)氧的需求。從圖6可見，在100 mL 的三角瓶中，培養(yǎng)基裝量為30～40mL，海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)糖較高，以裝量40mL時(shí)產(chǎn)糖最高。

2.4.3 接種量對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

按上述同樣培養(yǎng)條件，確定培養(yǎng)基裝量40mL，選取種子接入量分別為2%、4%、6%、8%、10%和12%，按實(shí)驗(yàn)方法“1.2.2”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定胞外多糖，結(jié)果如圖7所示。

圖7 接種量對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.7 Effect of inoculation quantity on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

在定量基質(zhì)培養(yǎng)基中，種子接入量過少，在一定時(shí)間菌株生長(zhǎng)達(dá)不到一定數(shù)量；種子接入量過多，菌體濃度過密，也影響其生長(zhǎng)，最終結(jié)果都會(huì)影響胞外多糖的產(chǎn)生。從圖7可見，6%的種子接入量，海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖效果較好。

2.4.4 培養(yǎng)溫度對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響

按上述同樣培養(yǎng)培養(yǎng)條件，確定種子接入量6%，分別在22、24、26、28、30和32℃條件下培養(yǎng)海洋細(xì)菌產(chǎn)胞外多糖，測(cè)其產(chǎn)糖量，結(jié)果見圖8。

圖8 溫度對(duì)海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.8 Effect of temperature on marine bacterium B1109producing exopolysaccharides

不同的微生物菌株有不同的適合生長(zhǎng)溫度，一般海洋微生物更適合較低的溫度，從圖8可見，隨著溫度升高，海洋細(xì)菌B1109 產(chǎn)糖量逐漸增大，26 ℃產(chǎn)糖達(dá)到高峰，28 ℃以上開始下降。

2.4.5 培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)

以培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以培養(yǎng)基裝量、溫度、接種量和培養(yǎng)基初始pH 培養(yǎng)條件為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)3個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平結(jié)果Tab.2 The result of orthogonal experiment factor horizontal

從表2的R值大小可知，各因素影響主次順序?yàn)椋築＞C＞A＞D，即培養(yǎng)溫度＞接種量＞培養(yǎng)基裝量＞培養(yǎng)基初始pH；產(chǎn)胞外多糖最優(yōu)水平組合為：A2B1C2D2，即培養(yǎng)溫度24 ℃，接種量6%，培養(yǎng)基裝量400mL/L，培養(yǎng)基初始pH 8.0。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，在確定的營(yíng)養(yǎng)成分碳源、氮源條件下，影響海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖的首要因素是培養(yǎng)溫度。海洋微生物長(zhǎng)期生長(zhǎng)在一個(gè)較低的溫度環(huán)境，其生長(zhǎng)和產(chǎn)生胞外多糖對(duì)溫度的要求較高，這符合海洋微生物的特性；其次是接種量，培養(yǎng)基裝量和培養(yǎng)基初始pH 影響不大。

2.5 海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖動(dòng)力曲線

以上述確定的最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)海洋細(xì)菌B1109，選取培養(yǎng)時(shí)間為24、48、72、96、120、144和168h，測(cè)定產(chǎn)胞外多糖和生長(zhǎng)情況，結(jié)果見圖9。

圖9 海洋細(xì)菌B1109生長(zhǎng)和產(chǎn)胞外多糖Fig.9 Growth and producing exopolysaccharides of marine bacterium B1109

由圖9可見，海洋細(xì)菌B1109從24h后就開始進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，96h達(dá)到生長(zhǎng)高峰，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。胞外多糖的產(chǎn)生的高峰時(shí)間是在120h，即在菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期之后，最高產(chǎn)糖為4.29g/L。

3 結(jié)論

海洋細(xì)菌B1109產(chǎn)胞外多糖最適碳源、氮源分別為葡萄糖和硫酸銨。質(zhì)量濃度分別為20和4g/L。其培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g/L，硫酸銨4g/L，酵母膏1g/L，蒸餾水400 mL/L，陳海水600mL/L，pH 8.0。

海洋細(xì)菌B1109 產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)條件為：100mL三角瓶裝量40 mL，接種量6%，24 ℃，200r/min

搖床培養(yǎng)120h。在此條件下，胞外多糖產(chǎn)量4.29g/L。

海洋細(xì)菌B1109培養(yǎng)24～96h為快速生長(zhǎng)期，96h以后進(jìn)入穩(wěn)定期。產(chǎn)胞外多糖高峰時(shí)期在穩(wěn)定期120h。