施莉娟，許 雷，溫 洋，蒲小鵬*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081）

豆科牧草是最具有經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值牧草之一，紫花苜蓿由于具有營養(yǎng)豐富、適應性強、改土固氮等多個優(yōu)點被人們冠以“牧草之王”的美稱[1]。近年來隨著DNA重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛利用，有關(guān)抗性紫花苜蓿新品種的研究也越來越多。國外已有將外源基因?qū)胱匣ㄜ俎＋@得再生植株的報道[2-4]。異源目的基因的高效遺傳轉(zhuǎn)化有賴于植物高頻再生體系的建立[5]，目前雖然已經(jīng)有許多學者對紫花苜蓿的組織培養(yǎng)進行了大量的研究工作[6-7]，許多實驗室也已經(jīng)成功建立了自己的紫花苜蓿再生體系，但大多數(shù)都是通過先誘導愈傷組織，然后誘導再生芽和根的途徑獲得再生植株[8]，普遍存在再生周期長、再生頻率低等不足[9]。作為基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)，必須克服這些缺點才能使通過基因轉(zhuǎn)化途徑改良性狀取得實質(zhì)性進展[10]。本研究通過對兩種再生途徑各個指標的比較，選擇出一種相對快速并且高效的再生方式，為今后通過基因轉(zhuǎn)化改良紫花苜蓿性狀建立穩(wěn)定高效的再生體系作準備。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗研究材料為新疆大葉紫花苜蓿（Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye）品種，種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學曹致中教授提供。

1.2 培養(yǎng)基組成

試驗中所用培養(yǎng)基成分如下：①基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，蔗糖3%，pH 5.8，附加不同激素，高溫滅菌；②愈傷誘導培養(yǎng)基：MS+2，4-D 2.0 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1+瓊脂 9 g·L-1；③ 分化培養(yǎng)基 1： MS+6-BA 0.5 mg·L-1L+NAA 0.05 mg·L-1+瓊脂 9 g·L-1；④ 分化培養(yǎng)基 2：MS+5 μmol·L-1TDZ+0.5 mg·L-1NAA+瓊脂0.8%；⑤生根誘導培養(yǎng)基：1/2MS+IBA 1 mg·L-1+蔗糖 1.5%+瓊脂 0.8%。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 胚胎發(fā)生途徑

1.3.1.1 外植體的獲得

選擇籽粒飽滿、有光澤的種子在流水下沖洗1 h，在超凈工作臺用70%的酒精浸泡50 s，無菌水沖洗3～5次，再用10%的次氯酸鈉震蕩處理30 min，無菌水沖洗6～8次，無菌濾紙吸干。將消過毒的苜蓿種子接種至不含激素的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室培養(yǎng)（光照培養(yǎng)，強度為1 000～2 000 lx，晝夜溫度為25℃左右）。20 d后取無菌幼苗的葉片作為試驗用外植體。

1.3.1.2 愈傷組織的誘導

參照梁慧敏等[11]、王瑞云等[12]方法，將20日齡的無菌苗葉片切成0.5 cm2左右的小塊接入愈傷誘導培養(yǎng)基[13]，每20 d繼代一次，培養(yǎng)條件為黑暗培養(yǎng)20 d后光照培養(yǎng)10 d；光周期16 h，光照強度1 000～2 000 lx，晝夜溫度為25℃左右。記錄外植體愈傷產(chǎn)生時間，30 d后統(tǒng)計出愈率、正常的愈傷組織率。

1.3.1.3 叢生芽的分化

愈傷組織經(jīng)過30 d的誘導，淘汰褐色的愈傷，篩選出呈黃白色、漿糊狀、水分含量高、表面有突起的組織（見圖版Ⅰ-A）接入分化培養(yǎng)基，一段時間之后，漿糊狀的胚狀體上出現(xiàn)許多綠色小顆粒（見圖版Ⅰ-B），當成團狀的胚狀體長得較大時，可將其分割培養(yǎng)，有利于體胚分化。每20 d繼代一次。培養(yǎng)條件為光周期16 h，光照強度1 000～2 000 lx，晝夜溫度為25℃左右。記錄出芽時間，統(tǒng)計芽分化率和單個組織生芽數(shù)（見圖版Ⅰ-C）。

1.3.1.4 根的誘導

待分化苗（見圖版Ⅰ-D）長至1 cm高時，在節(jié)間下部處將幼芽切下，移入生根培養(yǎng)基，每20 d繼代一次，記錄生根時間，統(tǒng)計生根率及單個幼苗生根數(shù)（見圖版Ⅰ-E）。

1.3.2 器官發(fā)生途徑

1.3.2.1 外植體的獲得

在滅過菌（方法同上）的種子中加入約50 mL的無菌水，置于黑暗中溫育過夜。第2天，在超凈臺上用解剖針將萌動的種子撥去種皮（見圖版Ⅰ-F），切去一部分胚根（見圖版Ⅰ-G），再將子葉從中間沿胚軸均勻平滑的分開（見圖版Ⅰ-H），作為本試驗的兩個外植體。將帶胚軸的子葉置于無激素的MS培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3 d。

1.3.2.2 叢生芽的分化

參照許仕珍[14]的方法，將暗培養(yǎng)3 d后出芽的外植體（見圖版Ⅰ-I）轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基2，送入培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件為光周期16 h，光照強度1 000～2 000 lx，晝夜溫度為25℃左右。20 d繼代一次。記錄出芽時間，25 d以后，統(tǒng)計出芽率及單個外植體產(chǎn)生再生芽的數(shù)量。

1.3.2.3 根的誘導

參照馬暉玲等方法[15]，將生長了一個月的叢生芽（見圖版Ⅰ-J）切開，把單個的再生芽轉(zhuǎn)入生根誘導培養(yǎng)基，記錄生根時間，20 d以后，統(tǒng)計生根率、單個幼苗（見圖版Ⅰ-K）生根數(shù)。

1.4 再生頻率的統(tǒng)計

紫花苜蓿從接種外植體到再生植株需要一段不短的時間，同時涉及好幾個關(guān)鍵階段，因而，評價苜蓿的再生頻率必須從這幾個階段綜合考慮。在理想狀態(tài)下（不考慮在試驗中因人為操作引起的污染等其他影響試驗結(jié)果統(tǒng)計的因素），用如下公式計算再生頻率[14]：

器官形成途徑：再生頻率（%）=外植體萌發(fā)率（%）×芽的分化率率（%）×平均單個外植體生芽數(shù)（個）×生根率（%）×平均單個幼苗生根數(shù)（個）；

胚胎發(fā)生途徑：再生頻率（%）=出愈率（%）×芽的分化率率（%）×平均單個外植體生芽數(shù)（個）×生根率（%）×平均單個幼苗生根數(shù)（個）；

其中：外植體出芽率（%）=萌發(fā)的材料數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

出愈率（%）=誘導出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

芽的分化率（%）=分化出芽的材料數(shù)/接種的材料總數(shù)×100%；

平均單個外植體生芽數(shù)（個）=分化的叢生小芽總數(shù)/從生芽總數(shù)；

生根率（%）=生根的幼苗數(shù)/接種的幼苗總數(shù)×100%；

平均單個幼苗生根數(shù)（個）=誘導生出的根總數(shù)/生根幼苗數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 再生時間的比較

本試驗中新疆大葉紫花苜蓿再生幼苗的生成，兩種途徑所用時間相差明顯，器官形成途徑中從種子消毒到再生幼苗的生成所需的時間為69 d左右（種子處理1 d+外植體預培養(yǎng)3 d+芽分化培養(yǎng)約25 d+生根約20 d+再生幼苗培養(yǎng)約20 d≈69 d），而胚胎發(fā)生途徑中從接種到再生幼苗的生成大約需要125 d（外植體的獲得20 d+愈傷誘導約30 d+芽分化約45 d+生根約30 d≈125 d）。利用成熟種子胚的再生方式最大特點就是不通過愈傷組織，直接誘導苜蓿叢生芽，其最大的優(yōu)點就是能快速地產(chǎn)生叢生芽，外植體接入芽分化培養(yǎng)基25 d后就可以用來生根。而傳統(tǒng)的胚胎發(fā)生途徑，外植體經(jīng)過脫分化形成愈傷組織后經(jīng)過再分化階段，然后才是根的誘導形成植株，本試驗中，兩種再生方式在生根時間上差異不是很大，最顯著的差異就是外植體的準備和芽分化上，本文中胚胎發(fā)生途徑選擇生長15～20 d時間的無菌苗葉片作為試驗外植體，即使外植體選擇準備時間較少的下胚軸也需要5～6 d，在這之后需要一個月左右的時間進行愈傷組織的誘導，從愈傷到分化出叢生芽又是一個很長的過程。而器官發(fā)生途徑中外植體的獲得僅需要1 d的種子預處理，接下來的過程又避開了愈傷組織誘導，25 d后就有叢生芽生出，并且每個芽又分離出好幾個小芽，直接進入生根階段，大大縮短了再生時間。顯然，器官形成途徑再生所需時間遠遠少于胚胎發(fā)生途徑，使再生幼苗的完成節(jié)約了55 d左右。

2.2 再生頻率的比較

從表1看出，新疆大葉紫花苜蓿器官發(fā)生途徑中子葉外植體的再生頻率（396.57%）是胚胎發(fā)生途徑中葉片外植體再生頻率（121.52%）的三倍多，最主要的差距還是在芽分化率上，器官發(fā)生途徑可以在較短的時間（約69 d）內(nèi)達到較高的分化率，而傳統(tǒng)的胚胎發(fā)生途徑經(jīng)過脫分化形成愈傷、再分化形成植株這樣一個漫長的過程后（約125 d），得到的再生頻率反而不是很理想，這也再次體現(xiàn)了紫花苜蓿再生體系的建立周期長、頻率低的特點。

表1 兩種再生途徑各項再生指標及再生頻率的比較Table1 Comparison of regeneration index and regeneration rate of two difference regeneration ways

3 討論與結(jié)論

直接誘導叢生芽的再生途徑具有再生周期短（69 d左右）、再生頻率高（396.57%）的特點，而傳統(tǒng)的再生方式大多數(shù)都是通過先誘導愈傷組織，然后誘導再生芽和根的途徑獲得再生植株，苜蓿愈傷再生成苗的主要問題是愈傷分化率偏低，不能滿足進行高效遺傳轉(zhuǎn)化研究的需要[16]。相比之下，器官發(fā)生途徑利用成熟種子的胚直接誘導叢生芽分化成苗，此過程不需要誘導愈傷，無論是再生周期還是再生頻率都具有明顯優(yōu)勢。用此種方式再生紫花苜蓿的報道國內(nèi)較少，研究不是很成熟，但是鑒于此方法的諸多優(yōu)點，有必要更進一步完善這一體系，以建立一套普遍適用的快速高效的紫花苜蓿再生體系，并推廣應用到其他植物中去[14]，這對將來的分子生物學研究具有重大的現(xiàn)實意義。

[1]馬海燕,張博,郝興明,等.新疆苜蓿愈傷組織再生體系建立的研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學,2005,42(1):19-23.

[2]李進軍,吳躍明,朱誠,等.苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化的研究進展[J].四川草原,2005(3):20-23.

[3]梁慧敏,夏陽,孫仲旭.根癌農(nóng)桿菌介導苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報,2005,13(2):152-156.

[4]Su Y,Wang P W,Dong Y S.Process of biotechnologe in alfalfa[J].Molecular Plant Breeding,2004,2(5):733-739.

[5]潘竟麗,曾幼玲,張富春.新疆大葉紫花苜蓿(Medicago sativa.L.cv.Xinjiang Daye)子葉、下胚軸、根的植株再生[J].中國農(nóng)學通報,2007,23(6):51-56.

[6]王強龍,王鎖民,張金林,等.紫花苜蓿體細胞胚高頻再生體系的建立[J].草業(yè)科學,2006,23(11):21-27.

[7]黃遠新,譚鵑,黃玉蘭,等.紫花苜蓿離體葉片愈傷組織誘導的研究[J].草業(yè)與畜牧,2008(6):1-10.

[8]錢謹.紫花苜蓿高頻再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導的木霉幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化的研究[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學,2006.

[9]王憑青,周興龍,楊青川,等.紫花苜蓿高頻再生組織培養(yǎng)體系建立[J].重慶大學學報:自然科學版,2005,28(2):132-136.

[10]梁美霞,劉守偉,李景富.農(nóng)桿菌介導的番茄遺傳轉(zhuǎn)化研究進展[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2004(2):118-122.

[11]梁慧敏,黃劍,夏陽,等.苜蓿組織培養(yǎng)高頻率再生體系的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報,2003,11:321-322.

[12]王瑞云,岳文斌,任有蛇.不同苜蓿品種對葉片愈傷組織誘導及植株再生的影響[J].中國草地,2004,26(2):36-43.

[13]鄭寶仁,王洪軍,盧寶偉.苜蓿子葉節(jié)離體培養(yǎng)體系的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2008,39(10):33-38.

[14]許仕珍.紫花苜蓿不同再生體系的比較及農(nóng)桿菌介導的ATNHX1基因轉(zhuǎn)化研究[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學,2006.

[15]馬暉玲,盧欣石,曹致中,等.紫花苜蓿不同栽培品種植株再生的研究[J].草業(yè)學報,2004,13(6):99-105.

[16]張萬軍,王濤.紫花苜蓿愈傷成苗高頻再生體系的建立及其影響因子的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2002,35(12):1579-1583.