雙 寶，李 明，李 成，王 晴，高繼國(guó)，向文勝，劉忠華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

瘦素（Leptin）主要是由肥胖基因（OB基因，位于人類染色體7q32）編碼的，在白色脂肪組織中產(chǎn)生的一種多肽類激素[1]。Leptin是一種分泌型蛋白質(zhì)，是一個(gè)分子質(zhì)量為16 ku的脂肪源循環(huán)蛋白，連同氨基端21個(gè)氨基酸的分泌信號(hào)序列共167個(gè)氨基酸。信號(hào)序列引導(dǎo)瘦蛋白進(jìn)入分泌途徑，最后被除去，因此在血液中循環(huán)的瘦蛋白為146個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[2]。

Leptin具有廣泛的生物學(xué)功能。它可以調(diào)節(jié)脂肪代謝和進(jìn)食量，對(duì)生殖、免疫功能、激素以及中樞神經(jīng)的早期發(fā)育都有作用[3]。它被廣泛地應(yīng)用于重要的生物學(xué)指標(biāo)[4-5]和疾病治療[6]。該基因的多態(tài)性[7-8]以及其在食品科學(xué)上的應(yīng)用[9]也受到了人們的重視。然而，Leptin的一些特性還有待進(jìn)一步考證。例如，Takeda指出Leptin可以控制骨頭的形成[10]，然而我國(guó)學(xué)者通過觀察生長(zhǎng)激素缺乏癥（GHD）兒童血清Leptin、骨鈣素水平的變化及兩者相關(guān)性分析，得出一個(gè)新的結(jié)論，認(rèn)為GHD兒童骨代謝的調(diào)控很可能與Leptin無關(guān)[11]。這就需要進(jìn)一步深入研究Leptin對(duì)骨代謝的作用。本試驗(yàn)克隆了人OB基因，使其產(chǎn)物L(fēng)eptin在原核生物大腸桿菌重組高量表達(dá)，為L(zhǎng)eptin的深入研究打下了良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 脂肪組織

取一例正常體重的急性闌尾炎患者（女性、36歲）腹壁脂肪組織，總量200 mg。取出后置-70℃保存，一周內(nèi)使用。

1.2 菌株和質(zhì)粒

菌株 E.coli XL1-Blue 和 E.coli BL21（DE3）質(zhì)粒pMD18-T Vector購(gòu)于寶生物公司，pET32a Vector為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 工具酶和試劑

總RNA提取試劑盒Trizol Reagent、RT-PCR一步反應(yīng)試劑盒（購(gòu)自GIBCO-BRL公司）；DEPC（購(gòu)自Invitrogen公司）；DNA Marker（購(gòu)自大連寶生物），蛋白質(zhì)小分子質(zhì)量Marker（ku）（購(gòu)自天根生物工程公司）；其他試劑均為Sigma公司或國(guó)產(chǎn)分析純生化試劑。DNA片段快速回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈?gòu)自北京博大泰克公司。

1.4 PCR引物

根據(jù)已報(bào)道的人Leptin基因（OB基因）去除信號(hào)肽的成熟區(qū)序列設(shè)計(jì)PCR引物，引物由北京賽百盛生物公司合成。其中5'引物中導(dǎo)入NdeⅠ酶切位點(diǎn)，3'引物中導(dǎo)入Eco RⅠ酶切位點(diǎn)（劃線部分）。

1.5 目的基因的擴(kuò)增

1.5.1 脂肪組織總RNA的制備

取脂肪組織100 mg放入1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol溶液，冰浴中勻漿數(shù)次后靜置5 min，2～8 ℃ 12 000 r·min-1離心 10 min，取下層勻漿液移至新EP管中加入200 μL氯仿，快速震蕩15 s后室溫放置 3 min，2～8 ℃ 11 000 r·min-1離心15 min，吸取水相，加入500 μL異丙醇，混勻后室溫放置 10 min， 2～8℃ 11 000 r·min-1離心 10 min，75%乙醇1 mL洗滌沉淀，2～8℃7 500 r·min-1離心5 min，棄乙醇真空抽干，溶于20 μL無RNA酶的水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

取5 μL所提取的脂肪組織總RNA為模板，利用RT-PCR一步反應(yīng)試劑盒進(jìn)行RT-PCR。

RT-PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：2×Reaction Mix 25 μL、5'引物（10 μmol·L-1）1 μL、3'引物（10 μmol·L-1）1 μL、RT/Taq Mix 1 μL、模板 5 μL、H2O 17 μL。

反應(yīng)步驟：50℃反應(yīng)20 min；94℃2 min后進(jìn)入以下程序：94℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸15 min。

1.5.3 配制瓊脂糖凝膠及電泳

1%的瓊脂糖膠、在RT-PCR產(chǎn)物中加入樣品緩沖液，電極緩沖液為1×TAE，100 V穩(wěn)壓電泳，至指示劑至適當(dāng)位置。

1.6 RT-PCR產(chǎn)物回收

依照鼎國(guó)生物工程公司DNA片段快速回收試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.7 測(cè)序質(zhì)粒構(gòu)建

將獲得的人Leptn基因PCR回收產(chǎn)物連入測(cè)序載體中。

連接反應(yīng)體系（10 μL）：pMD18-T Vector 1 μL、純化的OB基因 PCR產(chǎn)物 4 μL、SolutionⅠ5 μL。以上連接體系16℃反應(yīng)30 min后轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)菌，37℃培養(yǎng)過夜。

1.8 質(zhì)粒提取和純化

挑取單一克隆至2～5 mL含100 mg·L-1氨芐青霉素（Amp）液體LB培養(yǎng)基中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)后按照博大泰克生物工程公司質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖袑?shí)驗(yàn)方法提取質(zhì)粒。

1.9 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

分別將測(cè)序正確的pMD18-T-OB質(zhì)粒和大腸桿菌pET32a載體質(zhì)粒用NdeⅠ、Eco RⅠ進(jìn)行雙酶切，37℃酶切過夜，回收片斷，進(jìn)行片斷連接；轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞后提取質(zhì)粒，通過PCR和NdeⅠ-Eco RⅠ雙酶切鑒定。

1.10 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將經(jīng)PCR和NdeⅠ-Eco RⅠ雙酶切鑒定正確的pET32a-OB陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆分別接種含100 μg·mL-1氨芐青霉素（Amp）的液體LB培養(yǎng)基中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)后，以1：100分別稀釋至含Amp（100 μg·mL-1）的 LB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.4～0.6，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1 mmol·L-1，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，4 ℃、5 000 r·min-1離心10 min收集菌體。SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況，鑒定表達(dá)產(chǎn)物。陰性對(duì)照為在同等條件下不加誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增

以人脂肪組織中所提取的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)一條長(zhǎng)度約450 bp的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果相符（見圖1）。

2.2 測(cè)序質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

從電泳膠中純化回收RT-PCR產(chǎn)物，與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue。采用PCR和NdeⅠ-Eco RⅠ酶切方法鑒定，選取2個(gè)含有插入片斷的陽(yáng)性克隆用pMD18-T載體的上游通用M13-47引物進(jìn)行測(cè)序分析，其中，pMD18-T-OB 1序列與其他學(xué)者報(bào)道GI：904211的序列一致。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.1 PCR assay of recombinant plasmid

2.3 陽(yáng)性重組質(zhì)粒的鑒定

PCR鑒定出陽(yáng)性質(zhì)粒3個(gè)（見圖2），再用雙酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)在450 bp處有切出的特異帶，確定了這3個(gè)確為陽(yáng)性質(zhì)粒（見圖3）。

圖2 陽(yáng)性重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 PCR assay of positive recombinant plasmid

圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3 Digest assay of recombinant plasmid by Nde I and Eco R I

2.4 重組人Leptin蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)

將測(cè)序正確的pMD18-T-OB質(zhì)粒與大腸桿菌載體pET32a質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行NdeⅠ-Eco RⅠ雙酶切，回收純化酶切片斷后T4連接酶連接。經(jīng)PCR和NdeⅠ-Eco RⅠ雙酶切鑒定的pET32a-OB陽(yáng)性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)克隆培養(yǎng)，誘導(dǎo)后，收集菌體，并用菌體用煮沸法制成樣品，SDS-PAGE檢測(cè)到在分子質(zhì)量16 ku處有一特異性表達(dá)帶，通過凝膠掃描系統(tǒng)Alpha分析，表達(dá)的目的蛋白占總蛋白的20%（見圖4）。

圖4 表達(dá)蛋白SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of expressed protein

3 討論與結(jié)論

本研究采用RT-PCR技術(shù)人從脂肪組織提取總RNA，克隆到了人瘦素cDNA，序列分析顯示與其他學(xué)者的研究結(jié)果相同。為了獲得足夠量的蛋白用以進(jìn)一步的研究，選用簡(jiǎn)便、高效及便于生物學(xué)活性研究的原核表達(dá)系統(tǒng)載體pET32a進(jìn)行瘦素蛋白的體外表達(dá)，成功構(gòu)建了瘦素蛋白的原核表達(dá)載體pET32a-OB。將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)所獲得的目的蛋白與預(yù)期一致，目的蛋白的表達(dá)效率在20%以上。國(guó)內(nèi)瘦素的研究大多以探討其相關(guān)作用為主，而對(duì)其表達(dá)方面的研究尚不多見。通過對(duì)瘦素進(jìn)行高效表達(dá)就使得獲得大量的瘦素進(jìn)行更深入的試驗(yàn)成為可能。而且本實(shí)驗(yàn)室克隆表達(dá)的人的瘦素，為其應(yīng)用于臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

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