李嘉祺,趙文婧,張 茜,段學(xué)強(qiáng),單樹花

(太原師范學(xué)院生物系,山西太原 030031)

東北酸菜發(fā)酵中幾株乳酸菌的篩選

李嘉祺,趙文婧＊,張 茜,段學(xué)強(qiáng),單樹花

(太原師范學(xué)院生物系,山西太原 030031)

從東北酸菜汁液出發(fā),有目的地篩選到3株菌株,通過對其形態(tài)特征、菌落特征及生化特征進(jìn)行分析可知,3株菌株均為乳桿菌屬。對篩選到的乳桿菌屬進(jìn)行酸菜發(fā)酵性能研究發(fā)現(xiàn),其中菌株L2在發(fā)酵24 h后,產(chǎn)酸量達(dá)到2.5%,酸度達(dá)到1.73 g乳酸/100 mL,且發(fā)酵無異味,口味自然,效果較好。

乳酸菌;酸菜;選育

我國利用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵,加工、貯存蔬菜的方式已有幾千年的歷史了[1],并在全世界許多國家和地區(qū)廣為流傳。其方法簡便、易掌握,且能進(jìn)一步改善蔬菜風(fēng)味、增進(jìn)食欲[2]。我國蔬菜資源豐富,酸菜作為我國東北地區(qū)一種傳統(tǒng)的乳酸發(fā)酵蔬菜制品,口感清爽,營養(yǎng)豐富,風(fēng)味獨(dú)特[3],其汁液中富含乳酸菌活菌,賦予酸菜多種營養(yǎng)保健功效[4]。酸泡菜是世界性大眾化蔬菜發(fā)酵制品,其主要發(fā)酵菌群是乳酸菌。目前對西式泡菜、朝鮮泡菜、四川泡菜發(fā)酵過程中微生物區(qū)系已有較多研究,但對于酸菜這一中國東北地區(qū)特有發(fā)酵制品的微生物學(xué)研究及接種后發(fā)酵過程中乳酸菌種類的變化,國內(nèi)的報(bào)道還很有限。本研究旨在對傳統(tǒng)自然發(fā)酵的酸菜進(jìn)行乳酸菌的分離鑒定,為酸菜的純菌發(fā)酵和現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)[5-8],進(jìn)而探索出接種微生物純培養(yǎng)物促進(jìn)蔬菜發(fā)酵的新方法用于工業(yè)生產(chǎn)[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 酸菜(東北特產(chǎn))。

1.1.2 試劑 酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、溴甲基酚紫、磷酸氫二鉀、醋酸鈉、檸檬酸銨、硫酸鎂、Tween-80、鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈣、過氧化氫,均為分析純。

1.1.3 儀器 生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋。

1.1.4 培養(yǎng)基 ①初篩平板培養(yǎng)基:牛肉膏1%,酵母膏0.5%,蛋白胨1%,葡萄糖5%,瓊脂1.5%,溴甲基酚紫0.04%,磷酸氫二鉀0.2%,醋酸鈉0.5%,檸檬酸銨0.2%,硫酸鎂0.02%,Tween-800.1%,pH 6.6,121℃滅菌20 min;②復(fù)篩試管培養(yǎng)基:同初篩平板培養(yǎng)基,121℃滅菌20 min;③產(chǎn)乳酸鑒定[5]:通過紙層析乳酸定性試驗(yàn)確定出產(chǎn)乳酸細(xì)菌。紙層析法:濾紙,溶液系統(tǒng)為正丁醇∶甲酸∶水=10∶2∶15,顯色劑為0.04%溴酚乙醇溶液,0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至6.7,乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2%,標(biāo)準(zhǔn)液、各菌株發(fā)酵液以毛細(xì)管點(diǎn)樣,上行層析,顯色比較各斑點(diǎn)的Rf值;④生理生化特性鑒定[8]:a.生化特性研究(接觸酶反應(yīng)):將待鑒定菌種接種于乳酸菌培養(yǎng)基斜面上,37℃培養(yǎng)20 h后,在斜面上取1環(huán)接種菌苔于載玻片,然后滴加1滴過氧化氫溶液,觀察有無氣泡產(chǎn)生;b.生理特性研究(生長曲線的繪制):將分離出的菌株接到液體種子培養(yǎng)基中,每隔4 h吸取菌液,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),菌落總數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo),繪制生長曲線。斜面培養(yǎng)基:葡萄糖2%的MRS固體培養(yǎng)基,121℃滅菌20 min;④液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖5%MRS液體培養(yǎng)基,121℃滅菌20 min;⑤平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基:葡萄糖5%MRS固體培養(yǎng)基,121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離篩選[10]①初篩:取外觀無污染,味道純正的自然發(fā)酵酸菜液為分離樣,采用10倍梯度稀釋法,選擇適宜的稀釋度,涂布在乳酸菌初篩平板上,37℃下培養(yǎng)48 h,挑取溶CaCO3圈較大、培養(yǎng)基變黃的菌落;②復(fù)篩:將初篩得到的菌株用接種針轉(zhuǎn)接到復(fù)篩試管斜面培養(yǎng)基上,37℃下培養(yǎng)36 h,再挑選試管內(nèi)斜面培養(yǎng)基顏色變化較大的菌株,接到平板培養(yǎng)基上純化、分離出單菌落。

1.2.2 乳酸菌鑒定方法 ①形態(tài)特征鑒定[11]: a.菌落形態(tài):觀察平板培養(yǎng)基上菌落形態(tài),分離單菌落并記錄結(jié)果;b.菌株革蘭染色:將所分離的單菌落進(jìn)行革蘭染色,于100倍油鏡下觀察;c.菌落數(shù)的檢測:采用菌落平板計(jì)數(shù)法測定;②產(chǎn)酸量測定:采用0.1 mol/L的NaOH堿液滴定法,以酚酞為指示劑,分析結(jié)果以乳酸計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 菌種的初篩結(jié)果

以在初篩平板培養(yǎng)基上單菌落黃色菌圈大小進(jìn)行篩分,挑得120株菌。

2.2 菌種的復(fù)篩結(jié)果

取0.9 cm×9 cm試管,向其中注入3.0 mL的復(fù)篩試管培養(yǎng)基,擺斜面后轉(zhuǎn)接菌種,挑選試管內(nèi)培養(yǎng)基顏色變化較大的菌株,轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基上純化、分離單菌落,劃平板純化、分離,得到3株,編號分別為L1、L2、L3。

2.3 菌種的鑒定結(jié)果

根據(jù)菌種形態(tài)培養(yǎng)特征和革蘭染色、乳酸層析、接觸酶反應(yīng),目的菌株L1、L2、L3均為乳桿菌,鑒定結(jié)果如下。

2.3.1 形態(tài)鑒定結(jié)果 菌種的形態(tài)特征是鑒別菌種的重要特征參考,乳酸菌多為桿菌和球菌,革蘭染色多為陽性,但有些菌株培養(yǎng)時(shí)間過長會(huì)變?yōu)殛幮?。所篩選的產(chǎn)酸較高的3株菌37℃下,在分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h的菌落和鏡檢形態(tài)特征見表1、表2。

表1 菌株在分離培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Table 1 Morphological characteristics of strains

表2 菌株鏡檢形態(tài)特征及生化特性比較Table 2 Comparasion of morphological characteristics and biochemical characteristics

2.3.2 乳酸菌的鑒定結(jié)果 ①產(chǎn)酸量的測定:由表3結(jié)果可知,各菌株的溶CaCO3圈的大小與產(chǎn)酸量的多少呈正相關(guān);在篩選的3株菌株中以L2的溶CaCO3圈最大,產(chǎn)酸量也最多,達(dá)2.5%,其次為L3,產(chǎn)酸量為2.3%,再次為L1,產(chǎn)酸量為2.1%。其他菌株溶CaCO3圈均不如此3株菌株,因此,L1、L2、L3作為優(yōu)選出的3個(gè)高產(chǎn)酸菌株;②紙層析乳酸定性結(jié)果:采用乳酸定性分析,通過紙層析法對乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和L1、L2、L33株菌株的發(fā)酵液進(jìn)行對比試驗(yàn),結(jié)果表明,L2、L3和L1的發(fā)酵液中均含有乳酸,說明此3株菌株為產(chǎn)乳酸菌株。

表3 標(biāo)準(zhǔn)乳酸與幾株菌株發(fā)酵液紙層析的Rf值比較及產(chǎn)酸量Table 3 Comparasion of Rf value and acid production

2.3.3 生理生化特性鑒定結(jié)果 ①生化特性鑒定結(jié)果:接觸酶反應(yīng):過氧化氫酶能催化過氧化氫分解成氧和水,大多數(shù)乳酸菌觸酶反應(yīng)陰性,故此項(xiàng)測定是乳酸細(xì)菌鑒定的一個(gè)重要的依據(jù),反應(yīng)結(jié)果見表2、表4;②生理鑒定結(jié)果:L2、L3、L1菌株生長曲線見圖1,發(fā)酵過程酸度變化曲線見圖2。

圖1 L2、L3、L1菌株生長曲線Fig.1 Growth curves ofL2、L3、L1 strains

表4 L1、L2、L3的生化鑒定結(jié)果Table 4 Physiological and biochemical experiment ofL1、L2、L3

由圖1可見,L1菌株在培養(yǎng)4 h后即進(jìn)入對數(shù)生長期,20 h進(jìn)入穩(wěn)定期,L2和L3菌株具有類似的生長曲線,32～48 h進(jìn)入穩(wěn)定期。從3菌株的比較看,生長的前期以L1為主,后期以L2和L3為主。

圖2 發(fā)酵過程酸度變化曲線Fig.2 Fermentative process acidity change curve

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)從酸菜汁中分離出3株典型的產(chǎn)乳酸的菌株,經(jīng)紙層析法測定所產(chǎn)酸為乳酸,經(jīng)形態(tài)特征、菌落特征和生理生化特征鑒定均為乳桿菌屬; 3株菌在酸菜發(fā)酵過程中都表現(xiàn)出快速產(chǎn)酸、高發(fā)酵性能和良好的酸菜發(fā)酵環(huán)境適應(yīng)能力。其中菌株L2在發(fā)酵24 h后,產(chǎn)酸量達(dá)到2.5%,酸度達(dá)到1.53 g乳酸/100 mL,可知L2為酸菜發(fā)酵高產(chǎn)酸菌株,在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)時(shí)可以對L2菌株擴(kuò)大培養(yǎng),從而大大提高工業(yè)生產(chǎn)的效率。

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Screening of Some Lacto-Bacteria Strains from Sauerkraut Fermentation in NE China

LI Jia-qi,ZHAO Wen-jing,ZHANG Xi,DUAN Xue-qiang,SHAN Shu-hua
(Taiyuan Normal Uni.,Shanxi030031)

Three strains were screened intentionally starting from sauerkraut juice collected from NE China.It was known through analyses of their morphological,colony,and biochemistry features they all belonged to the genus of Lactobacillus.It was found after studying on 24 h after cabbage sauerkraut fer mentation that strain L2 produced acid as high as 2.5%,with the acidity at 1.73 g lactic acid/100 mL,and the fer mentation did not produced strange odor, the sauerkraut tasted natural and produced fine result.

lacto-bacteria;sauerkraut;breeding

Q93-331

A

1005-7021(2010)06-0068-03

太原師范學(xué)院2009年大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目

李嘉祺 女,生物技術(shù)專業(yè)。研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail:lijiaqi1861@163.com

＊通訊作者。E-mail:maomaozx@126.com

2010-09-07;

2010-11-05