任勇 張會(huì)萍 張萍 牛春

收稿日期：2022-10-16

作者簡(jiǎn)介：任勇，工程師，主要從事微生物菌種選育工作。

*通信作者：牛春，助理工程師，主要從事微生物菌種選育工作。

摘要：目的 以熱帶假絲酵母菌為試驗(yàn)菌株，通過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化，提高菌種發(fā)酵產(chǎn)酸量。方法 對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源和氮源等成分進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)研究了種齡、發(fā)酵培養(yǎng)溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、發(fā)酵接種量、發(fā)酵瓶裝量和發(fā)酵pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響。結(jié)果 發(fā)酵培養(yǎng)最適碳源為2 g/L蔗糖，最適氮源為3 g/L酵母浸膏，菌體發(fā)酵在28 ℃，200 r/min，25 mL/250 mL裝量，以15%接種量條件下培養(yǎng)，發(fā)酵pH值調(diào)至7.0～7.5時(shí)，十二碳二元酸平均產(chǎn)量可達(dá)到130 g/L。結(jié)論 對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源成分進(jìn)行優(yōu)化、發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵產(chǎn)酸量提高至130 g/L。同時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯化鈉和硫酸鎂后，均不利于菌種產(chǎn)酸。

關(guān)鍵詞：熱帶假絲酵母菌；碳源；氮源；十二碳二元酸；優(yōu)化；產(chǎn)酸量

中圖分類號(hào)：R978.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號(hào)：1001-8751（2024）02-0109-06

Optimization of Fermentation Process of Dodecarbon Acid bacteria strains

Ren Yong，? ?Zhang Hui-ping，? ?Zhang Ping，? ?Niu Chun

（Ningxia Tairui Pharmaceutical Co.， LTD.，? ?Yinchuan? ?750100）

Abstract： Objective To improve the acid production of Candida tropicalis by optimizing the fermentation process. Methods The effects of seed age， fermentation culture temperature， shake flask rotation speed， inoculation volume， filling volume， and sources for the 2 g/L of sucrose， the ideal nitrogen source for 3 g/L extract yeast， bacteria fermentation at 28 ℃， and fermentation pH value on acid production were also studied. The carbon source， nitrogen source， and other components in the fermentation medium were optimized. Results Fermentation to develop the optimal carbon 200 r/min， 25 mL/250 mL bottle， with a 15% seed volume， under the condition of fermentation pH value to 7.0～7.5， the average yield of dodecarbonate can reach 130 g/L. Conclusion The carbon and nitrogen supply components of the fermentation medium were improved， along with the fermentation process， resulting in an increase in the fermentation acid production to 130 g/L. At the same time， The addition of sodium chloride and magnesium sulfate in the fermentation medium is not conducive to the production of acid by the strains.

Key words： Candida tropicalis;? ?carbon source;? ?nitrogen source;? ?dodecarbonate;? ?optimize;? ?acid production of the strain

長(zhǎng)鏈二元酸，化學(xué)式為HOOC（CH2）nCOOH （n≥7） ，是指碳鏈中含有10 個(gè)以上碳原子的直鏈脂肪族二元羧酸。是一種重要的精細(xì)化工原料，可以合成特種尼龍、高級(jí)香料、高檔尼龍熱熔膠、高級(jí)潤(rùn)滑油、高級(jí)油漆、高級(jí)涂料和耐寒性增塑料等高附加值的特殊工業(yè)化學(xué)品種，也可以合成醫(yī)藥和農(nóng)藥等[1-3]，用途廣泛。目前，未見(jiàn)天然10個(gè)碳原子以上的二元酸的報(bào)道，多數(shù)通過(guò)人工合成獲取，其中化學(xué)合成法生產(chǎn)條件苛刻，工藝復(fù)雜，不環(huán)保，相比下微生物發(fā)酵法發(fā)展前景廣闊，工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值更高[4-5]。

十二碳二元酸（DC12）是長(zhǎng)鏈二元酸的一種，可由烷烴直接發(fā)酵獲取，以正構(gòu)烷烴為原料，利用熱帶假絲酵母菌的氧化性能，在常溫常壓下氧化正構(gòu)烷烴兩端的甲基，生成基質(zhì)烷烴相應(yīng)鏈長(zhǎng)的二元酸[6-8]。但在大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，存在正構(gòu)烷烴轉(zhuǎn)化率低，生產(chǎn)成本高等問(wèn)題，本文從發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)成分，發(fā)酵培養(yǎng)溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速、接種量和發(fā)酵瓶裝量等方面進(jìn)行優(yōu)化，以期為進(jìn)一步提高菌種產(chǎn)十二碳二元酸的能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）RRY-1，由寧夏泰瑞制藥有限公司菌種保藏室保藏。

1.1.2 儀器與試劑

紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司），立式搖床（樂(lè)山長(zhǎng)征制藥機(jī)械有限公司），電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），酸堿滴定管，正十二碳烷烴（純度≥98%，麥克林試劑）。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：麥芽汁10Be，瓊脂2%。

種瓶培養(yǎng)基：蔗糖5 g/L，酵母浸膏3 g/L，玉米粉1 g/L，尿素3 g/L，正十二烷烴86 g/L，磷酸氫二鈉7 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸膏3 g/L，尿素3 g/L，正十二烷烴175 g/L，磷酸氫二鈉6 g/L，蔗糖2 g/L。

1.1.4 培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)：將保藏菌種取一接種環(huán)于固體麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h。

種瓶培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的斜面取一環(huán)接種于液體培養(yǎng)基中，于28 ℃，200 r/min培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：以15%～20%接種量將種子液接種于裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，發(fā)酵在28 ℃，200? r/min培養(yǎng)144 h，檢測(cè)十二碳二元酸含量。

1.2 分析方法

1.2.1 菌體濃度（OD）的測(cè)定

取1 mL培養(yǎng)液，加蒸餾水稀釋30倍，混勻，吸取2 mL混勻液加入4 mL溶媒溶劑（氯仿∶乙醇∶正丁醇體積比為1∶10∶10），以溶媒溶劑作為空白對(duì)照，在620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌體濃度（OD）值。

1.2.2 十二碳二元酸的提取與測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，取適量發(fā)酵液沸水中加熱，用濃堿調(diào)pH至10～11，高速離心，去除上層烷烴和乳化物質(zhì)，同時(shí)棄去底部沉淀，剩余發(fā)酵液用濃酸調(diào)節(jié)pH至2左右，溶液中十二碳二元酸以白色晶體形式析出，高速離心分離出沉淀固體。用25 mL95%的中性乙醇溶解白色固體，加入兩滴酚酞，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，記錄消耗的氫氧化鈉體積，計(jì)算十二碳二元酸含量[9-10]。

十二碳二元酸產(chǎn)量（g/L）=MNV1/V2

式中：M表示十二碳二元酸的分子質(zhì)量（g/mol），N表示標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉濃度（mol/L），V1表示消耗氫氧化鈉的體積（mL），V2表示發(fā)酵液體積（mL）。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 種齡對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

不同培養(yǎng)周期的菌種成熟程度不同，對(duì)菌種的形態(tài)及代謝有很大的影響，選擇最適的種齡轉(zhuǎn)接發(fā)酵瓶，最大發(fā)揮菌種的生產(chǎn)能力。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中種瓶在28 ℃條件下分別培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，發(fā)酵培養(yǎng)條件不變，測(cè)定二元酸含量。

2.2 不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

微生物對(duì)各種碳源的需求不一樣，利用碳源時(shí)需要產(chǎn)生不同的酶來(lái)催化反應(yīng)，同時(shí)不同碳源的利用速度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量也有著很大影響，所以發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化意義很大。實(shí)驗(yàn)選用蔗糖、葡萄糖和麥芽糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基本碳源，發(fā)酵瓶在28 ℃，200? r/min培養(yǎng)144 h，發(fā)酵結(jié)束后，檢測(cè)不同碳源培養(yǎng)基中二元酸的含量。

2.3 不同氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

本實(shí)驗(yàn)選用酵母浸膏、酵母浸粉、酵母粉、玉米漿、蛋白胨、尿素和硫酸銨作為發(fā)酵培養(yǎng)基本氮源，發(fā)酵瓶在28 ℃，200? r/min培養(yǎng)144 h，發(fā)酵結(jié)束后，檢測(cè)不同氮源培養(yǎng)基中二元酸的含量。

2.4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

發(fā)酵瓶在其他培養(yǎng)條件不變情況下，分別在25 ℃、28 ℃、30 ℃和32 ℃下培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定十二碳二元酸的含量。

2.5 不同搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)條件不變情況下，發(fā)酵瓶分別在180? r/min、200? r/min、220? r/min和240? r/min的搖床培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定十二碳二元酸的含量確定最佳搖瓶轉(zhuǎn)速。

2.6 不同接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

種子液培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，以5%、10%、15%和20%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵瓶中，其他培養(yǎng)條件不變，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定十二碳二元酸的含量確定發(fā)酵最佳接種量。

2.7 不同裝量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

在適宜的條件下，發(fā)酵瓶分別裝量15mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL和40 mL，以15%的接種量轉(zhuǎn)入種子液，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定十二碳二元酸的含量確定發(fā)酵瓶最佳裝量。

2.8 發(fā)酵pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

發(fā)酵液過(guò)程中pH值對(duì)代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化影響至關(guān)重要。合適的pH值會(huì)促進(jìn)酶的活性，加速菌體轉(zhuǎn)化烷烴的速率。查閱相關(guān)論文[4]，發(fā)酵pH值酸性條件下不適合十二碳二元酸的轉(zhuǎn)化，pH值偏堿性會(huì)大量提高十二碳二元酸的合成，本實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵轉(zhuǎn)化烷烴時(shí)每隔24 h調(diào)節(jié)發(fā)酵液到指定pH值，考察pH值對(duì)菌體產(chǎn)酸量的影響。

2.9 無(wú)機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

無(wú)機(jī)鹽在發(fā)酵過(guò)程中有著重要作用，可以提供給微生物必要的營(yíng)養(yǎng)和維持適宜的環(huán)境條件，本文在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加氯化鈉和硫酸鎂兩種無(wú)機(jī)鹽，希望對(duì)提高二元酸的產(chǎn)量提供參考。

3 結(jié)果與分析

3.1 種齡對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

如表1所示，種瓶分別培養(yǎng)12 h、36 h、48 h、60 h和72 h，測(cè)定發(fā)酵瓶產(chǎn)酸量，前期種齡延長(zhǎng)發(fā)酵產(chǎn)酸量增大，種齡在48 h時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)酸量最大，隨著種瓶繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)酸量減少。種瓶培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌體數(shù)量增大，但菌體容易老化，轉(zhuǎn)入發(fā)酵瓶出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，不利于發(fā)酵產(chǎn)量的提高，由表提示，種齡48 h時(shí)發(fā)酵產(chǎn)酸量最大。

3.2 不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

如圖1所示，選用的三種碳源都可以被利用，其中蔗糖作為發(fā)酵基本碳源，發(fā)酵產(chǎn)酸量最高，然后是麥芽糖，最后是葡萄糖，檢測(cè)OD值蔗糖和麥芽糖OD值較高，葡萄糖次之。蔗糖與麥芽糖產(chǎn)酸量差別較小，兩者都是雙糖，在發(fā)酵產(chǎn)酸期延長(zhǎng)時(shí)，可以為菌體發(fā)酵持續(xù)提供能量，而葡萄糖容易被利用，不能滿足于菌體產(chǎn)酸的要求，所以發(fā)酵培養(yǎng)基中選用蔗糖作為碳源。

3.3 碳源濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中添加蔗糖對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量有著明顯的提高，分別用1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L和5 g/L五個(gè)濃度的蔗糖作為碳源，其他條件不變，發(fā)酵培養(yǎng)144 h 。結(jié)果如圖2所示，發(fā)酵產(chǎn)酸量隨著蔗糖濃度的增大先增大后降低，蔗糖濃度在2 g/L時(shí)發(fā)酵產(chǎn)酸量最大，發(fā)酵OD值也是先增大后降低。隨著蔗糖濃度的加大，增大了發(fā)酵培養(yǎng)基的黏度，減小了發(fā)酵溶氧量，從而影響菌種氧化烷烴的能力，所以，蔗糖添加濃度為2 g/L時(shí)發(fā)酵產(chǎn)酸量可維持較高水平。

3.4 不同氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

如圖3所示，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同類型氮源，添加酵母類的氮源、蛋白胨等有機(jī)氮源發(fā)酵產(chǎn)酸量整體偏高，其中酵母浸膏可以明顯提高發(fā)酵產(chǎn)酸量，酵母類氮源富含蛋白質(zhì)、氨基酸、肽、多肽、核酸、維生素及微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，可促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。添加尿素發(fā)酵產(chǎn)酸量次之，添加無(wú)機(jī)氮源硫酸銨后，搖瓶效價(jià)偏低未有明顯提高，硫酸銨在代謝過(guò)程中剩下酸根離子會(huì)對(duì)發(fā)酵pH值產(chǎn)生影響，從而影響發(fā)酵產(chǎn)酸水平。發(fā)酵使用玉米漿后，搖瓶效價(jià)低，玉米漿含糖量高，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，利于菌體大量生長(zhǎng)，但不利于菌體轉(zhuǎn)化烷烴生成產(chǎn)物。發(fā)酵最佳氮源選用酵母浸膏。

3.5 氮源濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

分別用1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L和6 g/L六個(gè)濃度的酵母浸膏作為氮源，其他條件不變，發(fā)酵培養(yǎng)144 h。如圖4所示，發(fā)酵產(chǎn)酸量隨著酵母浸膏濃度的增大先增大后降低，發(fā)酵OD值也是先增加后降低，所以酵母浸膏濃度為3g/L時(shí)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸有著促進(jìn)作用。

3.6 不同培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

如圖5所示，28 ℃培養(yǎng)發(fā)酵瓶，發(fā)酵產(chǎn)酸量最大，隨著發(fā)酵培養(yǎng)溫度升高，菌體產(chǎn)酸水平降低，32 ℃時(shí)菌體產(chǎn)酸量和OD值明顯降低。培養(yǎng)溫度影響菌體的生長(zhǎng)速度，培養(yǎng)基的蒸發(fā)量及產(chǎn)物的形成，培養(yǎng)溫度過(guò)高會(huì)影響菌體代謝相關(guān)酶的活性，甚至導(dǎo)致酶的失活。由圖可知熱帶假絲酵母菌在25～32 ℃都可生長(zhǎng)，但當(dāng)溫度超過(guò)32 ℃時(shí)，菌體發(fā)酵產(chǎn)酸量明顯降低，生物量也明顯降低，超過(guò)32 ℃不適合發(fā)酵培養(yǎng)菌種，所以菌體最適培養(yǎng)溫度為28℃。

3.7 不同搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

如圖6所示，發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)酸量最大。在發(fā)酵搖瓶中，一定發(fā)酵體積下提高搖瓶轉(zhuǎn)速，可以加快菌種的生長(zhǎng)速度，溶氧量也增大，但過(guò)高的轉(zhuǎn)速會(huì)形成剪切力，對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)造成破壞，進(jìn)而抑制菌體的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，搖瓶轉(zhuǎn)速在200? r/min、220? r/min、240? r/min時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)酸量相差不大，低轉(zhuǎn)速會(huì)更節(jié)約成本，確定發(fā)酵搖瓶轉(zhuǎn)速為200? r/min。

3.8 不同接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

如圖7所示，隨著發(fā)酵接種量的增大，發(fā)酵產(chǎn)酸量是先增加后降低，OD值先增加后降低，接種量為15%時(shí)發(fā)酵產(chǎn)酸量最大，接種量增大到20%發(fā)酵產(chǎn)酸量開(kāi)始降低，主要因?yàn)榫w接種量大，延滯期短，前期發(fā)酵速度快，但隨著后期發(fā)酵周期延長(zhǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本耗完，發(fā)酵速度降低從而影響發(fā)酵產(chǎn)酸水平。發(fā)酵接種量為15%，發(fā)酵培養(yǎng)144 h時(shí)產(chǎn)酸量最大。

3.9 不同裝量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

如圖8所示，隨著發(fā)酵瓶裝量的增大，發(fā)酵搖瓶的產(chǎn)酸水平整體呈降低的趨勢(shì)，OD值逐漸降低，發(fā)酵裝量25 mL時(shí)產(chǎn)酸量最大。發(fā)酵裝量越少，發(fā)酵液接觸空氣的面積越大，通氣量越大，發(fā)酵體積超過(guò)30 mL后，發(fā)酵產(chǎn)酸量明顯降低，熱帶假絲酵母菌為好氧菌，確定發(fā)酵最佳裝量為25 mL。

3.10 發(fā)酵pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

如圖9所示，發(fā)酵過(guò)程中調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值，發(fā)酵pH值在4.0～5.0時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)酸量極低，調(diào)節(jié)pH值在5.5以后，發(fā)酵產(chǎn)酸量開(kāi)始大量累積，發(fā)酵pH值在7.0～7.5時(shí)，二元酸含量達(dá)到最大值。當(dāng)發(fā)酵pH偏低時(shí)，發(fā)酵液中存在過(guò)多H+，細(xì)胞內(nèi)二元酸無(wú)法快速轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，抑制二元酸的轉(zhuǎn)化速率。當(dāng)發(fā)酵液pH調(diào)至堿性時(shí)，胞外OH-中和H+，加速了細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)堿性條件可以加快產(chǎn)物形成鹽，減少產(chǎn)物對(duì)酵母細(xì)胞的毒害作用，從而提高產(chǎn)物的累積。當(dāng)發(fā)酵pH值調(diào)節(jié)至8.0以后，二元酸產(chǎn)量開(kāi)始減少，由于發(fā)酵pH值過(guò)高，對(duì)細(xì)胞內(nèi)酶的活性有一定影響，使菌種代謝的速率減慢。在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵pH值調(diào)節(jié)在7.0～7.5時(shí)，有利于二元酸的轉(zhuǎn)化。

3.11 無(wú)機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸量的影響

如圖10所示，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的氯化鈉和硫酸鎂，經(jīng)搖瓶驗(yàn)證，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯化鈉和硫酸鎂后，二元酸的產(chǎn)酸量出現(xiàn)不同程度的降低，氯化鈉和硫酸鎂均不利于菌種發(fā)酵產(chǎn)酸。鈉離子可維持發(fā)酵液的離子平衡，保持適宜的滲透壓，但發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯化鈉后，菌種產(chǎn)酸量開(kāi)始降低，可能發(fā)酵培養(yǎng)基中已經(jīng)有磷酸氫二鈉，有足夠的鈉離子維持滲透平衡，再添加氯化鈉造成了細(xì)胞外部滲透壓高，不利于產(chǎn)物二元酸運(yùn)出細(xì)胞，抑制了代謝速率。鎂離子可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)酶的活性，但添加不同濃度硫酸鎂后，二元酸的產(chǎn)酸量逐漸降低，說(shuō)明鎂離子沒(méi)有起到促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化二元酸的生成，硫酸鎂不適合添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

4 討論

目前國(guó)內(nèi)主要通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸，由熱帶假絲酵母菌轉(zhuǎn)化正構(gòu)烷烴獲得相應(yīng)碳數(shù)的二元酸[4]，工業(yè)生產(chǎn)中主要選用：（1）選育優(yōu)勢(shì)菌株；（2）優(yōu)化培養(yǎng)基成分和優(yōu)化發(fā)酵工藝；（3）長(zhǎng)鏈二元酸分離提取工藝的改進(jìn)與優(yōu)化，通過(guò)上述三種方法來(lái)提高發(fā)酵產(chǎn)酸水平[4]。趙意平[7]通過(guò)對(duì)十二碳二元酸培養(yǎng)基碳源和氮源優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)菌體產(chǎn)酸培養(yǎng)基用2.0%蔗糖和0.5%葡萄糖的復(fù)合碳源比單一蔗糖產(chǎn)酸高14.5%；丁海燕等[11]研究發(fā)現(xiàn)菌體發(fā)酵適宜的氮源為2 g/L酵母膏和2 g/L尿素。本文以熱帶假絲酵母菌為試驗(yàn)菌株，主要進(jìn)行菌種發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和氮源優(yōu)化，確定了發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源為2 g/L蔗糖，最適氮源為3 g/L酵母浸膏，發(fā)酵搖瓶時(shí)菌體產(chǎn)酸量高且穩(wěn)定。同時(shí)進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，確定發(fā)酵最佳培養(yǎng)溫度為28 ℃，發(fā)酵搖瓶最佳轉(zhuǎn)速為200? r/min，最適接種量為15%，發(fā)酵最佳裝量為25 mL，菌種產(chǎn)酸能力可達(dá)到130 g/L。

長(zhǎng)鏈二元酸的生長(zhǎng)過(guò)程為非生長(zhǎng)偶聯(lián)型發(fā)酵[4]，酵母菌的增長(zhǎng)與發(fā)酵產(chǎn)物的積累無(wú)關(guān)聯(lián)。發(fā)酵前期大量生長(zhǎng)菌體，后期菌體達(dá)到一定數(shù)量進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酸所需的pH值不同，控制好pH值對(duì)產(chǎn)酸速率有著很大的影響。劉樹(shù)臣等[12]考察得出細(xì)胞外pH對(duì)熱帶假絲酵母菌細(xì)胞內(nèi)pH略有影響，生長(zhǎng)碳源對(duì)細(xì)胞內(nèi)pH影響明顯。肖云志等[13]研究表明，發(fā)酵初期不加入烷烴，待菌濃達(dá)到一定程度之后加入足量烷烴，發(fā)酵產(chǎn)酸量有所提高，還可以達(dá)到縮短發(fā)酵周期的目的。本文在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中調(diào)節(jié)pH值，驗(yàn)證發(fā)酵pH值對(duì)菌體產(chǎn)酸的影響，研究發(fā)現(xiàn)菌體在酸性條件下產(chǎn)酸率低，調(diào)節(jié)發(fā)酵pH到7.0～7.5時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)酸率達(dá)到最大值，發(fā)酵液在堿性條件更適合產(chǎn)物的合成。在接下來(lái)的研究中，將會(huì)對(duì)發(fā)酵底物烷烴的補(bǔ)料控制，溶氧控制等方面進(jìn)行優(yōu)化，以提高十二碳二元酸的產(chǎn)酸量。

參 考 文 獻(xiàn)

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