呂苗苗 牛春 石彥鵬 張萍

收稿日期：2023-06-28

作者簡介：呂苗苗，碩士，主要從事抗生素發(fā)酵菌種研究工作。

*通信作者：張萍，制藥工程師，主要從事生物發(fā)酵菌種改造、管理工作。

摘要：目的 篩選阿維鏈霉菌高產(chǎn)菌株。方法 采用ARTP誘變和aveR基因過表達(dá)2種選育方式對阿維鏈霉菌進(jìn)行復(fù)合篩選。結(jié)果 經(jīng)ARTP誘變篩選出RW-51誘變菌株效價(jià)為7 268? U/mL，高于原始菌株8.9%。再結(jié)合aveR基因過表達(dá)菌株的構(gòu)建，篩選出高產(chǎn)菌株RW-997初篩效價(jià)7 649 U/mL，高于RW-51誘變菌株7.7 %，高于原始菌株14.6 %。結(jié)論 篩選出1株高產(chǎn)菌株RW-997，用于大生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：阿維鏈霉菌；ARTP；過表達(dá)；轉(zhuǎn)化；接合轉(zhuǎn)移；菌種選育

中圖分類號：R978.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-8751（2024）02-0094-06

Compound Screening of High-yield Strain of Streptomyces avermitilis

Lv Miao-miao，? ?Niu Chun，? ?Shi Yan-peng，? ?Zhang Ping

（Ningxia Tairui Pharmaceutical Co.， Ltd.，? ? ?Yinchuan? ?750101）

Abstract： Objective The purpose of this study is to screen high-yield strains of Streptomyces avermitilis. Methods In this study， two breeding methods， ARTP mutation and aveR gene overexpression， were used to screen Streptomyces avermitilis. Results The RW-51 mutant strain used in this investigation had a titer of 7 268 U/mL， which was 8.9% greater than the original strain after ARTP mutagenesis screening. When the aveR gene was constructed and overexpressed， a high-yield strain RW-997 was screened with a titer of 7 649 U/mL， which was 14.6% greater than that of the original strain and 7.7% higher than that of the mutant strain RW-5. Conclusion One high-yielding strain RW-997 was selected for large-scale production.

Key words： Streptomyces avermitilis;? ?ARTP;? ?overexpression;? ?transformation;? ?conjugation transfer;? ?strain selection

阿維菌素（Avermectin）是由阿維鏈霉菌（Streptomyces

avermitilis）產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殺蟲劑，是一組由十六元環(huán)內(nèi)酯與一個(gè)齊墩果糖生成的苷。最初由日本學(xué)者大村智和美國Merk公司研究組在日本靜岡土壤中發(fā)現(xiàn)并分離，后經(jīng)鑒定其為一個(gè)新種，并發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液對動(dòng)物寄生蟲及多種農(nóng)業(yè)害蟲有極強(qiáng)的殺滅效果[1]。阿維菌素的天然發(fā)酵產(chǎn)物共有八個(gè)組分：A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b，其中B1a組分的殺蟲活性最高，毒性最小[2]。目前，市售阿維菌素農(nóng)藥是以Avermectin B1（Abamectin）為主要?dú)⑾x成分（阿維菌素B1a+B1b，其中B1a不低于90%，B1b不超過5%），以B1a的含量來標(biāo)定的。

相較于傳統(tǒng)誘變來說，等離子體誘變是一種有顯著優(yōu)勢的方法[3-7]，雖然等離子體誘變能夠產(chǎn)生較多的正突變體，但是實(shí)驗(yàn)操作簡便，深受大家的青睞。在特定條件下，通過控制等離子體處理時(shí)間，對微生物在DNA水平產(chǎn)生亞致死損傷，影響其代謝但不致死。

隨著技術(shù)的發(fā)展，對阿維菌素的研究不斷深入，2003年Nature Biotechnology期刊公布了其全基因組序列[8]，并獲得了整個(gè)大小約90 kb的阿維菌素生物合成基因簇。已有研究表明：aveR基因是阿維菌素生物合成基因簇的正途徑特異性調(diào)控基因，位于生物合成基因簇上游，其編碼的蛋白AveR能通過C-端的HTH結(jié)構(gòu)域與阿維菌素生物合成結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，正調(diào)控阿維菌素的合成，還負(fù)調(diào)控寡霉素的合成，從而提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[9-12]。本研究以提高阿維菌素生產(chǎn)水平為主，采用常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變和aveR基因過表達(dá)兩種選育方式對阿維鏈霉菌進(jìn)行復(fù)合選育，以篩選高產(chǎn)量的優(yōu)勢菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

阿維鏈霉菌來自寧夏泰益欣生物科技有限公司；大腸埃希菌E. coli ET12567、大腸埃希菌E. coli DH5α和pSET152來自寧夏泰瑞實(shí)驗(yàn)室；pGEM?-T Easy 載體購自Promega公司（表1）。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基[13]：LB培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、TSBY培養(yǎng)基。

分離培養(yǎng)基：葡萄糖4 g/L、蛋白胨3 g/L、酵母膏3 g/L、瓊脂粉20 g/L。

種子瓶培養(yǎng)基：玉米淀粉30 g/L、花生餅粉10 g/L、黃豆餅粉8 g/L、酵母膏4 g/L。

發(fā)酵瓶培養(yǎng)基：玉米淀粉120 g/L、黃豆餅粉28 g/L、硫酸銨0.25 g/L、輕質(zhì)碳酸鈣0.8 g/L、鉬酸鈉0.022 g/L、氯化鈷0.02 g/L、硫酸錳0.0022 g/L。

抗生素：安普霉素（Apr）、卡那霉素（Kan）、氯霉素（Chl）和萘啶酮酸鈉（ND）均購自大連美侖生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 常溫常壓等離子誘變方法

首先，制備孢子懸液，使其濃度控制在107 個(gè)/mL；其次，通過改變ARTP處理時(shí)間對孢子造成不同程度的損傷；最后，將處理的孢子洗下，稀釋涂布。一般稀釋10-2～10-3，以每個(gè)平板中的單菌落數(shù)量在20～50個(gè)為最佳，于28 ℃培養(yǎng)，待突變體長出。

1.2.2 質(zhì)粒提取及阿維鏈霉菌基因組提取

大腸埃希菌的提取方法、質(zhì)粒提取方法和質(zhì)?；厥辗椒ň鶇⒄誒mrge質(zhì)粒提取試劑盒系列使用說明。

阿維鏈霉菌基因組的提取，先將斜面菌體接種于LB培養(yǎng)基中，制備菌液，取培養(yǎng)液1～5 mL，10 000 r/min離心1 min，盡量吸凈上清，參照天根（Tiangen）試劑盒使用說明。

1.2.3 抗生素敏感性檢測

分別配制含有安普霉素、卡那霉素和萘啶酮酸鈉不同濃度梯度（0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、10.0 μg/mL、25.0 μg/mL、50.0 μg/mL和70.0 μg/mL）的MS培養(yǎng)基，空孵1 d，取制備好的單孢子懸液100 μL，均勻涂布于培養(yǎng)皿中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，定期觀察并統(tǒng)計(jì)單菌落形態(tài)與數(shù)量。

1.2.4 過表達(dá)菌株的構(gòu)建

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物。具體引物見表2。

以阿維鏈霉菌基因組DNA為模板，利用ermE*P和aveR基因的特異性引物獲得ermE*P和aveR基因片段，經(jīng)重疊延伸PCR技術(shù)將ermE*P和aveR基因片段連接成一條大片段E-R，純化回收。對質(zhì)粒pSET152和大片段分別進(jìn)行雙酶切，回收產(chǎn)物，經(jīng)T4連接酶連接，獲得重組質(zhì)粒PER，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌ET12567中。通過接合轉(zhuǎn)移方式[14-15]（參照鏈霉菌遺傳操作手冊）將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入阿維鏈霉菌RW-51中，最終獲得接合子。

1.2.5 菌株發(fā)酵及代謝產(chǎn)物分析

用接種鏟刮取適量孢子，接入種子瓶，28 ℃搖床培養(yǎng)48 h，后轉(zhuǎn)接發(fā)酵瓶，264 h后放瓶。取發(fā)酵液1 mL加入9 mL甲醇，混合均勻后超聲30 min，用濾紙過濾后經(jīng)HPLC檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變庫建立

2.1.1 ARTP誘變

誘變時(shí)間分別設(shè)置為0 s、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s和100 s，ARTP誘變處理之后將孢子液洗下，并稀釋到10-3，取100 μL涂布分離培養(yǎng)基中，培養(yǎng)直到長出誘變體單菌落，計(jì)數(shù)。其結(jié)果的如圖1所示，隨著處理時(shí)間的增大，孢子的致死率逐漸上升，當(dāng)誘變時(shí)間為80 s時(shí)，致死率達(dá)到98.03 %，當(dāng)處理時(shí)間為70 s時(shí)，致死率為90.7%，在這個(gè)致死率范圍，可能獲得更多的突變體并且有較大機(jī)會獲得正突變體，提示可選擇70 s作為誘變處理時(shí)間。

2.1.2 高產(chǎn)菌株篩選

將經(jīng)過ARTP誘變的孢子涂布于分離培養(yǎng)基中，將長出的誘變體單菌落經(jīng)過發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)，用HPLC測定其阿維菌素的效價(jià)，其結(jié)果如圖2所示，以阿維菌素出發(fā)菌株的效價(jià)為100%，將初篩中阿維菌素的效價(jià)高于出發(fā)菌株5%的突變菌株作為正突變菌株，經(jīng)ARTP誘變處理的100株突變菌株中，篩選出14株正突變菌株，正突變率為14%。

2.1.3 高產(chǎn)菌株復(fù)篩及其遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

將初篩結(jié)果中阿維菌素效價(jià)高于出發(fā)菌株5%的14株突變菌株進(jìn)行發(fā)酵搖瓶復(fù)篩，結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示，突變菌株中效價(jià)最高的菌株是RW-51突變菌株，其次是RW-7突變菌株，以阿維菌素出發(fā)菌株的效價(jià)為100%，RW-51突變菌株復(fù)篩的效價(jià)百分比為111%，RW-7突變菌株復(fù)篩的效價(jià)百分比為105%。而在發(fā)酵搖瓶初篩中RW-51突變菌株較出發(fā)菌株高出16%，RW-7突變菌株高出14%，由此可見，經(jīng)過2次發(fā)酵搖瓶驗(yàn)證，篩選出2株高單位菌株。

將復(fù)篩篩選出的2株高產(chǎn)菌株連續(xù)傳5代，驗(yàn)證突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4所示，隨著傳代次數(shù)的增加，突變菌株發(fā)酵水平逐漸下降，這與放線菌容易發(fā)生自然退化及突變菌株發(fā)生的回復(fù)突變有關(guān)。其次，經(jīng)5代發(fā)酵搖瓶驗(yàn)證，高產(chǎn)菌株RW-7的阿維菌素發(fā)酵水平低于出發(fā)菌株；而高產(chǎn)菌株RW-51依舊保持較高的阿維菌素發(fā)酵水平，RW-51效價(jià)為7 268 U/mL，較出發(fā)菌株提高了8.9%。同時(shí)，對突變菌株發(fā)酵搖瓶40 h的種子液鏡檢，結(jié)果如圖5所示，對照菌的菌絲相比RW-51高產(chǎn)菌菌絲纖細(xì)，RW-51高產(chǎn)菌菌絲短粗且分枝多，相互纏繞，結(jié)網(wǎng)緊實(shí)。

2.2 過表達(dá)菌株的數(shù)據(jù)分析

2.2.1 抗生素敏感性檢測

首先對阿維鏈霉菌生產(chǎn)菌株RW-51進(jìn)行抗生素敏感性檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。由此可見，阿維鏈霉菌生產(chǎn)菌株RW-51對安普霉素和卡那霉素比較敏感，在MS培養(yǎng)基上分別添加2.0 μg/mL和4.0 μg/mL可以完全抑制出發(fā)菌RW-51的生長。對萘啶酮酸鈉不敏感。因此，選用安普霉素為抗性篩選標(biāo)記，選用萘啶酮酸鈉來抑制大腸埃希菌。

2.2.2 重組質(zhì)粒PER的構(gòu)建

酶切電泳圖6顯示，1號為重組質(zhì)粒，酶切得到清晰的兩條帶，2號為空質(zhì)粒酶切后僅得到一條線性質(zhì)粒條帶，后經(jīng)測序驗(yàn)證顯示重組質(zhì)粒PER構(gòu)建成功。

2.2.3 過表達(dá)菌株的構(gòu)建

利用已建立的接合轉(zhuǎn)移體系，將重組質(zhì)粒PER轉(zhuǎn)入阿維鏈霉菌RW-51中，經(jīng)抗性篩選獲得過表達(dá)菌株，對其進(jìn)行菌液聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）驗(yàn)證，同時(shí)對其進(jìn)行基因組提取，利用引物P-F/R-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。如電泳圖7所示，1號為出發(fā)菌株，未擴(kuò)增出目的基因；2號為過表達(dá)菌株，3號為重組質(zhì)粒PER，均獲得3 153 bp目的條帶，可見過表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

2.2.4 過表達(dá)菌株的發(fā)酵搖瓶驗(yàn)證

通過接合轉(zhuǎn)移方式成功構(gòu)建過表達(dá)菌株148株，經(jīng)過發(fā)酵搖瓶初篩，篩選出69株，再經(jīng)過發(fā)酵搖瓶復(fù)篩選取3株高單位菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4。這3株過表達(dá)菌株的效價(jià)分別為7 554 U/mL、7 649 U/mL和7 471 U/mL，均高于RW-51菌株效價(jià)的5%以上。aveR基因是阿維菌素生物合成基因簇的正途徑特異性調(diào)控基因，對次級代謝產(chǎn)物有促進(jìn)的作用，可見適當(dāng)提高aveR基因的表達(dá)量，可以提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

2.2.5 過表達(dá)菌株的遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

對這3株過表達(dá)菌株進(jìn)行傳代驗(yàn)證，傳5代后對其進(jìn)行基因組的提取，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，均獲得3 153 bp目的條帶，由此可見，質(zhì)粒pSET152能夠穩(wěn)定地存在于阿維鏈霉菌中；同時(shí)，對其進(jìn)行發(fā)酵搖瓶驗(yàn)證，如圖8。在3株過表達(dá)菌株中，RW-997的穩(wěn)定性相對較高，連續(xù)5代搖瓶結(jié)果比較穩(wěn)定，且發(fā)酵單位也存在一定優(yōu)勢。其余2株過表達(dá)菌株在第1代之后發(fā)酵單位出現(xiàn)明顯下降趨勢。

3 結(jié)論與展望

經(jīng)ARTP誘變實(shí)驗(yàn)，阿維菌素高產(chǎn)菌株正突變率為14%。篩選出RW-51突變株，其發(fā)酵搖瓶初篩較出發(fā)菌株高出16%，經(jīng)過連續(xù)5代驗(yàn)證后RW-51依舊保持較高的阿維菌素發(fā)酵水平，效價(jià)為7 268 U/mL較出發(fā)菌株提高了8.9%。在此基礎(chǔ)之上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至阿維鏈霉菌RW-51中，篩選出3株過表達(dá)菌株，其效價(jià)分別為7 554 U/mL、7 649 U/mL和7 471 U/mL，均高于阿維鏈霉菌RW-51效價(jià)的5%以上，高于原始菌株12%以上。對其進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證顯示，僅RW-997的穩(wěn)定性相對較高，傳5代搖瓶效價(jià)達(dá)7 486 U/mL。將高產(chǎn)菌RW-997推廣至大生產(chǎn)中，發(fā)酵罐放罐效價(jià)達(dá)到7 895 U/mL，可見，該高產(chǎn)菌存在一定的優(yōu)勢。

目前，我國雖已成為最大的阿維菌素原料藥生產(chǎn)國，但國內(nèi)企業(yè)還面臨著單位效價(jià)偏低的情況[16]，因此，優(yōu)化菌種，提高阿維菌素產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本是重要的課題。阿維鏈霉菌的基因水平研究的不斷深入，以代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)為主的現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用加之企業(yè)的科研投入的不斷提高[17]，將大幅度地提高企業(yè)中阿維菌素的生產(chǎn)水平，降低企業(yè)的生產(chǎn)成本。本研究采用復(fù)合選育方式不僅篩選出了用于實(shí)際大生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株RW-997，還為接下來的阿維菌素選育工作提供了幫助。

參 考 文 獻(xiàn)

Burg R W， Miller B M， Baker E E， et al. Avermectins， new family of potent anthelmintic agents：producing organism and fermentation[J].Antimicrob Agents Chemother，1979， 15（3）： 361-367.

Egerton J R， Ostlind D A， Blair L S， et al. Avermectins，new family of potent anthelmintic agents： efficacy of the B1a component[J].Antimicrob Agents Chem， 1979， 15（3）： 372-378．

張萍， 丁亞蓮， 牛春. 尼莫克汀高產(chǎn)菌株誘變選育研究[J]. 國外醫(yī)藥（抗生素分冊）， 2022， 43（05）： 356-361.

李艷青， 戴劍漉， 蔣忠科， 等. 常壓室溫等離子體-紫外復(fù)合誘變選育新硫肽類抗生素166A高產(chǎn)菌株[J]. 中國抗生素雜志， 2022， 47（05）： 514-520.

徐瑤. 基于常溫常壓等離子體（ARTP）誘變的阿維鏈霉菌工業(yè)菌株選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化[D]. 上海： 華東理工大學(xué)， 2019.

趙鵬鵬， 郄麗萍， 馬婕， 等. 替考拉寧高產(chǎn)菌選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 中國抗生素雜志， 2022， 47（06）： 569-574.

曹曉梅. 阿維菌素高產(chǎn)菌株的定向選育[D]. 無錫： 江南大學(xué)， 2018.

Ikeda H， Ishikawa J， Hanamoto A， et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial? microorganism Streptomyces avermitilis[S]. Nat Biotechnol， 2003， 21（5）： 526-531.

鐘芳敏. 阿維菌素B1a高產(chǎn)菌株的選育及分子改造[D]. 福州： 福建師范大學(xué)， 2016.

李淑煥， 薄永恒. 阿維菌素生物合成基因結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展[J]. 山東畜牧獸醫(yī)， 2019， 40（07）：72-74.

張曉琳.阿維鏈霉菌中聚酮合酶基因的遺傳改造[D].北京： 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2004.

蔡新露，許婉蓮，許玉榮，等.林可霉素基因工程研究的新進(jìn)展[J].中國抗生素雜志， 2022， 47（06）：521-527.

呂苗苗， 楊光耀， 田平雅， 等. 阿維菌素生產(chǎn)菌的復(fù)合誘變[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2021（02）：61-65.

張桂敏， 周秀芬， 鄧子新. 透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）在阿維鏈霉菌的整合表達(dá)[J].中國抗生素雜志， 2005（03）：138-142.

孟令卓， 王勇， 儲炬. 阿維鏈霉菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化及其不同PKS敲除菌株的構(gòu)建[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志， 2018， 49（08）： 1112-1120.

緱仲軒， 和鳳， 李紫萱， 等. 阿維菌素研究進(jìn)展與產(chǎn)業(yè)綜述[J]. 中國抗生素雜志， 2022， 47（11）： 1139-1148.

王欣榮， 唐智超， 曾茂， 等. 刺糖多孢菌高產(chǎn)菌株轉(zhuǎn)錄組及其多殺菌素合成代謝調(diào)控研究[J]. 中國抗生素雜志， 2022， 47（06）： 561-568.