武繼民，汪鵬飛，李志宏，劉永清，袁曉燕

(1. 天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所，天津 300161)

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factors，bFGF)是一種具有廣譜作用的促進(jìn)組織或血管形成生長(zhǎng)因子[1-2]．bFGF與其他生長(zhǎng)因子一樣，在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中它是聯(lián)結(jié)細(xì)胞行為的專一信號(hào)因子，在創(chuàng)傷愈合中起到促血管化的主要作用 ，因此bFGF及其制劑的相關(guān)應(yīng)用研究一直是組織工程支架材料、再生醫(yī)學(xué)及創(chuàng)傷治療領(lǐng)域最活躍的課題之一．但是，bFGF作為一種堿性多肽[5]，在體內(nèi)擴(kuò)散快、對(duì)熱和酸敏感、易被蛋白酶分解、半衰期短，因此其生物學(xué)效應(yīng)不能得到充分發(fā)揮．如何有效地發(fā)揮 bFGF的生物學(xué)效應(yīng)制約著 bFGF的進(jìn)一步體內(nèi)應(yīng)用研究，藥劑學(xué)的緩釋技術(shù)較好地解決了這個(gè)問題．通過微球包埋，使 bFGF與外界的酶解環(huán)境相對(duì)隔離，能夠在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)緩釋藥物并使局部藥物濃度維持在一個(gè)相當(dāng)?shù)乃剑?/p>

通過溶劑揮發(fā)法，以bFGF為藥物、PLGA為高分子載體材料制備 bFGF-PLGA微球，對(duì) bFGF進(jìn)行控釋釋放研究，取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5-6]．但是，藥物的微球緩釋技術(shù)雖然具有很大的開發(fā)潛力，卻仍存在很多問題．其中藥物體外釋放過程中的突釋問題就是制約微球制劑臨床應(yīng)用的一個(gè)重要因素．膠原作為一種比較理想的天然載體材料，具備作為活性因子載體的基本條件，尤其是膠原海綿在作為組織工程支架或創(chuàng)傷敷料方面頗具優(yōu)勢(shì)[7]．筆者通過 bFGFPLGA微球與膠原基質(zhì)的復(fù)合，制備載有 bFGFPLGA微球的膠原海綿，將 bFGF-PLGA微球包埋在膠原海綿表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)當(dāng)中，能夠很好地解決藥物釋放過程中的突釋問題，同時(shí)膠原基質(zhì)與 bFGF具有生物學(xué)上的協(xié)同作用，二者結(jié)合能夠更好地發(fā)揮其生物學(xué)作用[8]．

1 材料和方法

1.1 試劑與設(shè)備

1.1.1 主要試劑

重組人的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 rh bFGF，70,000,Au/支，北京雙鷺生物制藥有限公司．bFGF標(biāo)準(zhǔn)品，9,800,IU/mL，中國(guó)藥品生物制品檢定所．膠原，本實(shí)驗(yàn)室自制．乳酸-羥基乙酸共聚物 poly(lactic-coglycolic acid)，PLGA(75/25)，相對(duì)分子質(zhì)量 5.0×104，山東醫(yī)療器械研究所．聚乙烯醇 PVA，純度96%～98%，水解度 98%，聚合度 1,750±50，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司．酶聯(lián)吸附免疫法 ELISA試劑盒，Sigma公司．二氯甲烷等其他試劑均為分析純．

1.1.2 主要設(shè)備

JSM-6700F型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(日本)．X-520型高速勻漿機(jī)(美國(guó))．78-1型磁力加熱攪拌器(江蘇金壇市富華電器廠)．CR22G型超速冷凍離心機(jī)(日本)．Freezone6型真空冷凍干燥機(jī)(美國(guó))．DH4000A型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特醫(yī)療器械廠)．SHACA型水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)．MULTISKAN MK3全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó))．

1.2 方法

1.2.1 bFGF-PLGA微球和載荷微球膠原海綿的制備

采用溶劑揮發(fā)法制備包埋 bFGF的 PLGA微球．將水溶性的 bFGF溶于生理鹽水中作為內(nèi)水相(W1)，PLGA 溶于二氯甲烷中作為油相(O)，2%的PVA水溶液作為外水相(W2)．(W1/O/W2的體積比為15∶2∶50，油相中 PLGA 濃度 10,mg/mL，)．將 W1逐滴滴入O中，以高速勻漿機(jī)在30,000,r/min下乳化1,min形成初乳(W1/O)；待初乳穩(wěn)定后，將初乳液滴入一定體積不同濃度的 PVA水溶液中(W2)，15,000,r/min下攪拌3,min形成復(fù)乳(W1/O/W2)．然后將復(fù)乳液倒入燒杯中，室溫下磁力攪拌揮發(fā) 3～5,h，過濾，3,500～5,000,r/min離心 15～20,min，去離子水洗滌、過濾后再離心，如此反復(fù)操作 3～5遍，直至將多于的PVA清除．將樣品-20,℃冷凍保存至少48,h；冷凍干燥24,h，收集微球粉末待用．

精確稱取定量的 bFGF-PLGA緩釋微球，均勻分散于膠原溶液中，將分散好的膠原凝膠置入直徑6,cm 厚 5,mm 的模具中，于 4,℃下靜置 24,h后，再在-20,℃冷凍 48,h，冷凍干燥 24～36,h，得到載荷bFGF-PLGA微球的膠原海綿．

1.2.2 bFGF-PLGA微球、膠原海綿及載荷微球膠原海綿的形貌觀察

制作相應(yīng)的掃描電鏡觀察樣品，觀察表面形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步了解微球與膠原海綿的復(fù)合情況．

1.2.3 ELISA檢測(cè)法及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)試，采用抗人bFGF單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 bFGF與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人 bFGF抗體(二抗)，它將與結(jié)合在單抗上的人的 bFGF結(jié)合而形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與二抗的生物素結(jié)合，加入TMB顯色．在450,nm處測(cè)其吸光度(OD值)，bFGF濃度與OD值呈正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中bFGF濃度．

做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，要扣除標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液造成的本底．如果標(biāo)本用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋，也要扣除標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液造成的本底；如果標(biāo)本未用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋，標(biāo)本不需扣除標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液造成的本底．以標(biāo)準(zhǔn)品濃度 600 pg/mL、300 pg/mL、150 pg/mL、75 pg/mL、37.5,pg/mL、18.75,pg/mL、9.38,pg/mL、0,pg/mL 之 OD值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，建立bFGF的標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出標(biāo)準(zhǔn)方程(圖略)．然后根據(jù)樣品 OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)bFGF含量．

1.2.4 bFGF-PLGA微球中bFGF的載藥量和包封率測(cè)定

稱取20,mg微球，加入2,mL的二氯甲烷中，使其完全溶解，再加入1,mL 0.1,mol/L PBS緩沖溶液(pH=7.2)，充分?jǐn)嚢琛㈧o置、分液，收集水相凍存，利用ELISA測(cè)定樣品OD值．根據(jù)樣品OD值及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)液中 bFGF的濃度，從而計(jì)算出微球中的bFGF含量，即可得微球的載藥量和包封率．

1.2.5 微球及載荷微球海綿的體外釋藥行為測(cè)定

精確稱取定量微球及載荷微球海綿置于透析袋中，緊密封口，然后置于 20,mL作為緩釋介質(zhì)的 PBS緩沖溶液(pH＝7.2)中，37,℃下以100,r/min的速率恒溫恒速振蕩．分別在第 1/2,d、1,d、2,d、3,d、5,d、8,d、12,d、17,d、23,d、30,d、35,d、45,d 定時(shí)移去 2 mL 釋放介質(zhì)于離心管中標(biāo)號(hào)凍存待測(cè)并補(bǔ)充同樣體積的新鮮緩沖液．以PBS緩沖溶液為空白對(duì)照，ELISA法測(cè)吸光度值，檢測(cè)bFGF濃度．

式中：m1為微球或載荷微球海綿在緩沖液中溶出bFGF的量；m2為微球或載荷微球海綿中 bFGF的總量．

2 結(jié)果與討論

2.1 微球表面形貌

經(jīng) SEM 觀察，bFGF-PLGA微球表面光滑，球形好，且球呈中空狀．膠原海綿內(nèi)壁平滑，有明顯的纖維形態(tài)．如圖1所示．

圖1 bFGF-PLGA微球和膠原海綿的表觀形貌SEM圖Fig.1 SEM images of morphology of bFGF-loaded PLGA microspheres and collagen sponge

2.2 載荷bFGF-PLGA微球膠原海綿的形貌特征

圖 2為不同放大倍數(shù)下載荷微球膠原海綿的電鏡照片．從圖2可以看出，表面呈凸起狀，微球絕大部分包埋于膠原海綿內(nèi)壁．這種進(jìn)一步包被從形態(tài)上可能避免藥物釋放過程中的突釋期，在一定程度上改善了藥物的體外釋放行為，使釋放更加平穩(wěn)并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間．

圖2 不同放大倍數(shù)下載荷微球海綿的形態(tài)結(jié)構(gòu)SEM圖Fig.2 SEM images of morphology of collagen sponge integrated with bFGF-PLGA microspheres in different multiples

2.3 bFGF-PLGA微球載藥量、包封率和體外釋藥性質(zhì)

經(jīng)檢測(cè)和計(jì)算，bFGF-PLGA緩釋微球的載藥量和包封率均值分別為0.059 9%± 0.001 9%和79.9% ±2.8%(n＝5)，釋藥行為測(cè)定結(jié)果見圖3．該載荷bFGF微球的膠原海綿的體外釋藥結(jié)果顯示其體外釋藥過程較為穩(wěn)定．膠原海綿載荷微球后，從第 5,d起開始平穩(wěn)釋放直至第 35,d(圖中近乎直線形式)．而微球本身從第 8,d后才平穩(wěn)釋放．bFGF微球載荷在膠原海綿后，bFGF突釋率(突釋率為微球中藥物在第 1,d的累積釋放率，由圖 3可得出相應(yīng)數(shù)據(jù))為 14.6%，小于微球本身的突釋率 20.0%，證明微球與膠原海綿的復(fù)合能夠有效地減小藥物的突釋現(xiàn)象，這與海綿進(jìn)一步包裹藥物微球有關(guān)．

近年來，組織工程研究愈來愈接近臨床應(yīng)用，而組織工程支架材料是其真正得到規(guī)模應(yīng)用的根本．像細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的結(jié)構(gòu)與功能那樣，只有在支架材料中載荷穩(wěn)定而又控釋的生長(zhǎng)因子，才會(huì)對(duì)細(xì)胞和組織的生存提供理想的環(huán)境．本文所構(gòu)建的載荷 bFGF-PLGA微球的膠原海綿有望發(fā)展成為一種具有對(duì) bFGF進(jìn)行中長(zhǎng)期緩釋功能的組織工程支架，為研制符合臨床治療需要的中長(zhǎng)效注射制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)．同時(shí)，載荷 bFGF-PLGA微球的膠原海綿支架的研究又為深度創(chuàng)傷敷料的組織修復(fù)奠定基礎(chǔ)．bFGF的持續(xù)釋放特點(diǎn)將有效地促進(jìn)組織再生和血管化過程[9]，期望載荷 bFGF微球的膠原海綿成為理想的組織工程支架材料或創(chuàng)傷修復(fù)材料．

圖3 bFGF-PLGA微球及其載荷微球膠原海綿的體外釋藥曲線Fig.3 In vitro release curves of bFGF-loaded PLGA Fig.3 microspheres with and without collagen sponge

3 結(jié) 論

(1)bFGF-PLGA微球表面圓滑，載藥量和包封率分別達(dá)到 0.059 9%± 0.001 9%和 79.9% ± 2.8%．

(2)bFGF-PLGA微球的膠原海綿緩釋體系中，微球包埋在膠原海綿表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)當(dāng)中，分散均勻．

(3)bFGF-PLGA微球的膠原海綿，體外釋放藥物比較穩(wěn)定，較之微球本身，其藥物有效緩釋時(shí)間更長(zhǎng)．通過 bFGF-PLGA 微球與膠原基質(zhì)的復(fù)合，能夠有效解決藥物釋放過程中的突釋問題，突釋率由20.0%降到14.6%．

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