黃婭琳

（1.南京森林警察學(xué)院，江蘇南京210046；2.國家林業(yè)局野生動植物物證鑒定中心，江蘇南京210046）

利用唾液斑DNA上12S rRNA基因片段進行動物種屬鑒定

黃婭琳1，2

（1.南京森林警察學(xué)院，江蘇南京210046；2.國家林業(yè)局野生動植物物證鑒定中心，江蘇南京210046）

目的通過檢測唾液斑DNA確定案件所涉及動物的種屬。方法通過提取動物唾液斑DNA，擴增其線粒體DNA上的12S rRNA基因片段，并進行DNA測序，測序結(jié)果在GenBank上進行BLAST搜索，再利用DNAMAN軟件進行同源性分析。結(jié)果從唾液斑中成功地提取到了基因組總DNA，并成功擴增出了用于動物種屬鑒定的12S rRNA基因片段。結(jié)論所報道的方法能用于動物種屬鑒定。

唾液斑DNA；12S rRNA；種屬鑒定

Abstract：Objective To identify the genus of animals that are related to cases by analyzing DNA from salivary stain.Methods After isolating DNA from salivary stain of animals，partial mitochondrion DNA of 12S rRNA gene were amplified and sequenced. Then the obtained sequence was searched with BLAST in the GenBank database，and the homology analysis was carried out using DNAMAN software.Results The genome DNA was successfully extracted from salivary stain and partial mitochondrion DNA of 12S rRNA gene were amplified.Conclusion The introduced method is applicable for classification of aminals.

Key words：salivary stain DNA；12S rRNA；animal classification

近年來，受經(jīng)濟利益驅(qū)使，非法收購、運輸、出售野生動物及家畜的案件日趨增多。在許多案件中，由于送檢樣本非常微量，利用普通的形態(tài)學(xué)鑒定方法很難識別動物種屬。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記及序列測定技術(shù)已越來越多地用于動物種屬鑒定和親子鑒定（如：牛、馬、羊等家畜被盜案件），在案件的偵破過程中發(fā)揮著重要作用。在某些案件中，由于被鑒定的動物是活體，為避免在采集樣本時對動物造成損害以及降低采樣難度，通常提取動物唾液，并制成唾液斑送檢。本研究擬通過提取動物唾液斑DNA，擴增其線粒體DNA上的12S rRNA基因片段，并對其進行DNA序列分析，以確定動物種屬。

1 材料與方法

1.1 材料

廣西省森林公安局送檢的帶動物唾液斑的紗布

1.2 方法

1.2.1 唾液斑DNA的提取

剪取紗布上唾液斑（約1 cm×1 cm大小），置于1.5 mL離心管中，用硅珠法[1]提取樣品DNA。用分光光度法檢測樣本DNA的純度和濃度。將樣品總DNA置于-20℃保存，待用。

1.2.2 PCR擴增

擴增線粒體DNA上12S rRNA基因片段采用通用引物：L1091和H1478[2]。實驗設(shè)3個平行管及陰性對照。擴增反應(yīng)在Biometra PCR儀（德國BIOMETRA公司，Tgradient）上進行?？偡磻?yīng)體積為25 μL，其中含2.5 pmol/μL引物各2 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，1.25 U Ex Taq酶0.25 μL，10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，10-20 ng/μL模板1-2 μL（空白對照不加模板DNA），其他為滅菌蒸餾水。PCR反應(yīng)所需試劑及引物均購自Takara公司。上述反應(yīng)體系在94℃預(yù)變性3min，然后進入如下程序：94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸7min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用DL2000（大連Takala生物技術(shù)公司）作為分子量標(biāo)記，用凝膠成像系統(tǒng)（基因有限公司，GENEGENUS）檢測、成像。

1.2.3 PCR擴增片段測序

PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物（小量）純化試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）純化。以純化產(chǎn)物為模板DNA，用ABI公司測序試劑盒進行測序PCR擴增（操作按試劑盒說明），擴增產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺變性后，上ABI公司3130xl測序儀進行測序。

1.2.4 BLAST搜索及序列對比

將測序結(jié)果在GenBank中進行BLAST搜索，并從數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)物種的序列，用DNAMAN生物學(xué)軟件進行同源性分析，確定動物種屬。

2 結(jié)果

分光光度法測得唾液斑樣本基因組總DNA的OD260/OD280為1.72，表明DNA純度較高。樣本總DNA濃度為18 ng/μL。

圖1示唾液斑樣本基因組總DNA電泳結(jié)果，由圖可見，當(dāng)上樣量為10μL時，檢測到基因組總DNA（箭頭所示），表明樣品中提取到的總DNA質(zhì)量較高。此外，樣品總DNA在分子量較小位置存在涂抹彌散（smear）現(xiàn)象，這可能是由于DNA部分降解或存在已降解的RNA的原因?？瞻讓φ展苤袥]有檢測到DNA。

圖1 樣本基因組總DNA瓊脂糖電泳圖

以唾液斑樣本基因組總DNA為模板，擴增線粒體DNA上12S rRNA基因片段（圖2），得到了清晰的PCR產(chǎn)物（箭頭所示）。空白對照無擴增產(chǎn)物。

將PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)3130xl測序儀進行測序，（結(jié)果如圖3所示），得到416 bp的序列。經(jīng)BLAST搜索、DNAMAN同源性分析，發(fā)現(xiàn)所檢測的樣本DNA保守片段序列與黃牛（Bos Taurus）線粒體DNA 12S rRNA基因序列的部分片段的同源性高達(dá)100%，據(jù)此推斷唾液斑樣本種屬為黃牛。

圖2 樣本mtDNA 12S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物

圖3 樣品的mtDNA 12S rRNA基因序列

3 討論

血液是傳統(tǒng)上獲取DNA的來源，但對于動物，尤其是猛獸，進行活體血樣采集難度較大，常常需要麻醉動物。與之相比，唾液的采集較為容易，不會對動物造成傷害。人類口腔粘膜的上皮為復(fù)層鱗狀上皮，具有代謝旺盛、更新快、易脫落的特點。它由多層細(xì)胞組成，基底層具有旺盛分裂能力，最表層的角化層已衰老退化，不斷脫落。角化層細(xì)胞可以自然脫落到唾液中。這些細(xì)胞雖然細(xì)胞核固縮，但同樣具有完整的基因組DNA序列，含有與白細(xì)胞、肝細(xì)胞等一致的高度多態(tài)性STR位點[3]，從而成為動物DNA種屬鑒定以及法醫(yī)學(xué)人類DNA多態(tài)性檢測分型的生物性檢材。各類口腔上皮脫落細(xì)胞檢材所含的細(xì)胞量較少，DNA的含量常為微克級或納克級，甚至為皮克級水平，為微量生物性檢材[4]。因此，如何成功地獲得足夠量的DNA用于PCR擴增尤為重要。

本研究利用硅珠法成功提取了唾液斑中的DNA。硅珠法的基本過程是：裂解細(xì)胞、硅珠吸附DNA、洗滌硅珠-DNA復(fù)合物、溶解DNA、離心去除硅珠。其基本原理是：在高濃度的硫氰酸胍存在時，DNA能夠被二氧化硅特異性吸附；當(dāng)硫氰酸胍被洗滌干凈后，DNA又可從二氧化硅上解離下來。硫氰酸胍是高性能的蛋白變性劑，可以使蛋白質(zhì)與DNA充分分離，在硅珠吸附前高速離心，可以將不溶的物質(zhì)去除；吸附后的漂洗過程，則將溶解的PCR抑制劑洗去。因此，提取DNA的靈敏度比較高、速度快且不會受檢材條件的影響。此外，本研究用針對mtDNA上12S rRNA基因片段的通用引物進行PCR擴增，獲得了高純度的目的基因片段，并利用Gen-Bank上豐富的序列資源，通過BLAST搜索、同源性比對確定唾液斑樣本種屬來源為黃牛。12S rRNA基因進化速度適中，一個較小的基因片段就包含了從種內(nèi)到種間的進化遺傳信息[5]，同時，GenBank中已經(jīng)積累了大量的關(guān)于12S rRNA基因的序列資源，可為物種鑒定提供豐富的比照資源，也將為各類案件中的野生動物及其制品的鑒定帶來極大的便利。

[1]王林生，蘇勇，顧林崗.硅珠法提取PCR模板DNA[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2000，15（1）：36-37.

[2]Kocher T，W Thomas，A Meyer，et al.Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals：amplification and sequencing with conserved primers[J].Proc Natl Acad Sci，1989，86（16）：6196–6200.

[3]張越，梅善宗.微量口腔粘膜脫落細(xì)胞檢材STR位點的法醫(yī)學(xué)檢測分型[J].皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，24（1）：74-76.

[4]徐慶，高金林，裴軍昌，等.口腔脫落細(xì)胞DNA檢驗在刑事案件中的應(yīng)用[J].泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2007，7（1）：70-71.

[5]Irwin D M，Kocher T D，Wilson A C.Evolution of the cytochrome b gene of mammals[J].J Mol Evol，1991，32（2）：128-144.

（本文編輯：李莉）

Animal Classification Using 12S rRNA Gene from Salivary Stain DNA

HUANG Ya-lin1，2
（1.Nanjing Forest Police College，Nanjing 210046，China；2.Wildlife Material Evidence Appraisal Center of National Forestry Administration，Nanjing 210046，China）

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2010.05.008

1671-2072-（2010）05-0043-02

2010-03-30

南京森林警察學(xué)院教研基金資助項目（ZD09202）

黃婭琳（1976-），女，博士，主要從事野生動植物物證鑒定。E-mail：huangyalin228@yahoo.com.cn。