林娟霞,陳利強,孫美珍#,王明正

1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經(jīng)內科,太原 030001;2.山西醫(yī)科大學神經(jīng)藥理教研室,太原 030001

林娟霞1,陳利強1,孫美珍1#,王明正2

1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經(jīng)內科,太原 030001;2.山西醫(yī)科大學神經(jīng)藥理教研室,太原 030001

目的:觀察耐藥蛋白抑制劑維拉帕米對難治性癲大鼠的療效及海馬P-糖蛋白表達的影響。方法:W istar大鼠50只,隨機分為生理鹽水組(NS組)、匹羅卡品組(PILO組)、卡馬西平組(CBZ組)、低劑量維拉帕米組(LDV組)和高劑量維拉帕米組(HDV組),氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射制作大鼠自發(fā)性癲模型,選擇耐藥癲大鼠,分別給予常規(guī)或添加維拉帕米抗癲治療,觀察大鼠性發(fā)作頻率及海馬P-糖蛋白表達的變化。結果:與NS組相比,其它4組大鼠性發(fā)作頻率增高,海馬P-糖蛋白表達增強(P＜0.05);LDV組和HDV組大鼠的性發(fā)作頻率及海馬P-糖蛋白表達較PILO組和CBZ組降低(P＜0.05);PILO組和CBZ組大鼠性發(fā)作頻率及海馬P-糖蛋白表達無明顯差異,LDV組和HDV組大鼠性發(fā)作頻率及海馬P-糖蛋白表達無明顯差異。結論:添加維拉帕米治療可明顯減少難治性癲大鼠性發(fā)作頻率,降低難治性癲大鼠海馬P-糖蛋白的表達。

難治性癲;維拉帕米;P-糖蛋白

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物:成年雄性Wistar大鼠50只,體質量260～300 g,由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。②主要試劑與材料:LiCl、PILO(購于Sigma公司),大鼠抗P-gp單克隆抗體(購于北京博奧森公司),免疫組化試劑盒(購于北京中杉金橋公司)。

1.2 方法

1.2.3 免疫組織化學染色 灌胃治療3周后,4%多聚甲醛灌注固定大鼠,斷頭取腦,常規(guī)制作石蠟切片,免疫組織化學法檢測各組大鼠海馬P-gp的表達,具體操作嚴格參照試劑盒說明書進行。采用Immage-Pro Plus5.0軟件,每張切片隨機取6個視野,根據(jù)切片中陽性面積率,即視野陽性細胞面積/視野總面積(Object/Total,O/T)進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以(x±s)表示,F檢驗,各組間比較采用SNK-q檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.3 海馬P-gp免疫組化檢測結果 光鏡下正常大鼠腦組織細胞形態(tài)完整,細胞核呈均一藍色。P-gp陽性細胞黃染,主要位于細胞膜和細胞質;神經(jīng)元、膠質細胞及血管內皮細胞均可見陽性表達。神經(jīng)元陽性染色顯示胞體呈圓形,帶有一條長突起;膠質細胞陽性染色顯示胞體形狀多樣,可以為三角形、橢圓形或不規(guī)則形,見圖1A-E。NS組大鼠海馬內有少量細胞表達P-gp,O/T值為(2.53±0.31)%;與NS組比較,其它4組P-gp表達均增強(P＜0.05);PILO組O/T值為(8.60±0.50)%,CBZ組O/T值為(9.16±0.58)%,2組間無明顯差異;LDV組O/T值為(5.15±0.33)%,低于 PILO組及CBZ組(P＜0.05);HDV 組O/T值為(4.94±0.35)%,低于PILO組及CBZ組(P＜0.05);LDV組與HDV組間無明顯差異。

圖1 A-E NS組(A)、PILO組(B)、CBZ組(C)、LDV組(D)和HDV組(E)大鼠海馬P-gp免疫組化染色結果(×400)

3 討論

P-gp是MDR1的主要表達產(chǎn)物,研究認為RE患者及實驗動物腦組織中P-gp的過量表達,是導致腦組織中 AEDs濃度下降,引起耐藥的重要原因[6,7]。目前針對P-gp過量表達引起的耐藥已研制出多種P-gp抑制劑。維拉帕米是鈣通道阻斷劑,主要用于治療心律失常;它也是一種耐藥蛋白抑制劑,是P-gp底物轉運部位的競爭性配體,可被P-gp泵到細胞外,減少P-gp對化療藥物的外排[8]。研究顯示,維拉帕米可升高癲大鼠腦細胞外液中AEDs的濃度[9,10],增加RE患者復雜部分癲發(fā)作的時間間隔,改善癲控制效果[11,12]。

本實驗結果顯示,在CBZ治療基礎上添加維拉帕米,可明顯降低自發(fā)性癲大鼠性發(fā)作頻率,減少海馬區(qū)P-gp表達。推測維拉帕米對RE的治療作用機制可能有:①通過與P-gp競爭性結合,減少P-gp對CBZ的外排,提高腦內細胞外液CBZ濃度,增強其抗癲作用;②降低RE大鼠腦內P-gp的含量;③作為鈣離子拮抗劑,抑制鈣離子內流,維持細胞內鈣穩(wěn)定,減少性發(fā)作頻率;④降低細胞內游離鈣濃度,抑制蛋白激酶C活性,調節(jié)P-gp功能[13]。本實驗維拉帕米2個劑量組療效無明顯差別,可能與所設劑量組偏少及藥劑量偏小有關。綜上所述,本模型可作為RE耐藥模型用于P-gp的相關研究及抗耐藥癲藥物的篩選;維拉帕米可降低P-gp表達,緩解RE的耐藥現(xiàn)象,為RE治療提供新方向。

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Ef fects of Verapam il on Refractory Epilepsy and on Exp ression of P-glycop rotein in the H ippocampus in Rat Model

LIN Juan-xia▲,CHEN Li-qiang,SUN Mei-zhen,W ANG M ing-zheng.▲Departmentof Neurolog y,The First Hosp ital,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

Ob jective:To investigate the therapeutic effect of verapam ilon refractory epilepsy and theeffectof vrerapm il on expression of P-glycop rotein(P-gp)in the hippocampus in ratmode lof refractory epilepsy.M ethod:A ratmodelof spontaneous recurrent seizures(SRS)has been generated through lithium-pilocarpine lumbar injection.The SRS rats with drug resistance were selected and random ly divided into the control,the pilocarpine,the carbamazepine,the low-dose verapam il and the high-dose verapam il group.The frequency of SRS and theexpression of P-gp in hippocampus of rats have been documented.Resu lts:The frequency of SRS and the expression of P-gp in hippocampus in the control group were significantly lower than that in the other four groups(P＜0.05).The frequency of SRSand theexpression of P-gp in hippocampus in both the low-dose and the high-dose verapamilgroupsw ere significantly lower than those in the carbamazepine and the pilocarpine groups(P＜0.05).There w as no differences betw een the carbamazepine group and the pilocarpine group and no difference betw een the low-dose and the highdose verapamilgroup either.Conclusion:Treatment of verapamilmay significantly decrease the frequency of SRS and lower the expression of P-gp in hippocam pus in SRS rats with drug resistance.

refractory epilepsy;verapam il;P-glycoprotein

R741;R741.05

A

1001-117X(2010)01-0021-03

10.3870/sjsscj.2010.01.007

2009-07-06

#【通訊作者】孫美珍,Tel:86-351-4639667,E-mail:meizhensun23@yahoo.com。