黎明，歐秀元，楊向東，郭東全，錢雪艷，邢來(lái)君，魏東盛，李明春

1 南開(kāi)大學(xué)微生物學(xué)系 分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071

2 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457

3 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，長(zhǎng)春 130033

工業(yè)生物技術(shù)

小眼蟲藻Δ8-脂肪酸脫氫酶基因的克隆及其在釀酒酵母中的表達(dá)

黎明1,2，歐秀元1，楊向東3，郭東全3，錢雪艷3，邢來(lái)君1，魏東盛1，李明春1

1 南開(kāi)大學(xué)微生物學(xué)系 分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071

2 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457

3 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，長(zhǎng)春 130033

Δ8途徑是合成多不飽和脂肪酸的替代途徑，Δ8-脂肪酸脫氫酶是該途徑的關(guān)鍵酶之一。根據(jù)已報(bào)道的Δ8-脂肪酸脫氫酶基因設(shè)計(jì)引物，分別從小眼蟲藻基因組DNA和cDNA中擴(kuò)增得到該基因片段，序列分析表明：結(jié)構(gòu)基因長(zhǎng)1 266 bp，編碼421個(gè)氨基酸；該基因沒(méi)有內(nèi)含子，比已經(jīng)報(bào)道的Δ8-脂肪酸脫氫酶基因長(zhǎng)6 bp，并且N末端序列也有所不同。利用釀酒酵母的載體pYES2.0構(gòu)建Δ8-脂肪酸脫氫酶表達(dá)載體pYEFD，并轉(zhuǎn)化到營(yíng)養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株INVSc1中，在選擇培養(yǎng)基中篩選得到釀酒酵母轉(zhuǎn)化菌株YD8。YD8在合適的培養(yǎng)條件下，添加外源底物二十碳二烯酸和二十碳三烯酸并誘導(dǎo)基因表達(dá)。脂肪酸甲酯氣相色譜分析表明小眼蟲藻Δ8-脂肪酸脫氫酶基因在釀酒酵母中獲得了高效表達(dá)，將二十碳二烯酸和二十碳三烯酸分別轉(zhuǎn)化成二高-γ-亞麻酸和二十碳四烯酸，其底物轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了31.2%和46.3%。

Δ8-脂肪酸脫氫酶，小眼蟲藻，多不飽和脂肪酸

Abstract:Δ8desaturase pathway, different from common Δ6desaturase pathway, is an alternate pathway of polyunsaturated fatty acids biosynthesis. Δ8-fatty acid desaturase is one of the key enzymes in Δ8desaturase pathway. Two specific fragments were separately cloned from genomic DNA and cDNA ofEuglena gracilisby PCR with the primers designed according to the reportedsequence. Comparison of the genomic and cDNA sequences revealed that there wasn’t intron in this Δ -fatty acid desaturase gene.This gene has an open reading frame of 1 266 bp that encodes 421 amino acids. It is 6 bp longer than the reported gene sequence, and also showed certain difference from the reported sequence in the N-terminal. The recombinant expression plasmid pYEFD by subcloning Δ8-fatty acid desaturase gene into the yeast-E. colishuttle vector pYES2.0 was constructed and was transformed into the defective mutant INVSc1 ofSaccharomyces cerevisiaeby electrotransformation. The resulting strain YD8 harboring plasmid pYEFD was selected and was cultured in the induction medium with exogenous substrates ω6-eicosadienoic acid and ω3-eicosatrienoic acid for the expression of Δ8-fatty acid desaturase gene. The results indicated that high level expressed Δ8-fatty acid desaturase could convert ω6-eicosadienoic acid and ω3-eicosatrienoic acid to dihomo-γ-linolenic acid and eicosatetraenoic acid with substrate conversion ratio 31.2% and 46.3%, respectively.

Keywords:Δ8-fatty acid desaturase,Euglena gracilis, polyunsaturated fatty acids

多不飽和脂肪酸 (Polyunsaturated fatty acid，PUFAs) 是指含有2個(gè)或2個(gè)以上順式雙鍵、碳原子數(shù)為 16至 22的直鏈脂肪酸[1]。主要包括 γ-亞麻酸(γ-linolenic acid，GLA)、二高-γ-亞麻酸(Dihomo-γlinolenic acid，DGLA)、花生四烯酸 (Arachidonic acid，ARA)、二十碳五烯酸 (Eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸 (Docosahexaenoic acid，DHA) 等。多不飽和脂肪酸是以多種形式存在于細(xì)胞中，如細(xì)胞膜、儲(chǔ)存脂、甘油三酯磷脂、鞘脂和脂蛋白等。作為生物膜結(jié)構(gòu)中磷脂的重要成分之一，PUFAs的種類、數(shù)量、飽和度的改變會(huì)直接影響生物膜的剛性結(jié)構(gòu)，因此影響了與剛性結(jié)構(gòu)相關(guān)的各種生理功能。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)PUFAs與包括心血管疾病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、潰瘍性結(jié)腸炎在內(nèi)的多種慢性疾病相關(guān)，并且可以通過(guò)影響細(xì)胞的增殖和信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展情況[2-4]。最近的研究表明，PUFAs還能影響骨骼的生長(zhǎng)與修復(fù)過(guò)程。不僅如此，PUFAs還能作為一種重要的生理活性物質(zhì)影響胎兒的發(fā)育[5]。因此PUFAs的生物合成以及合成途徑中的一些關(guān)鍵酶受到廣泛的關(guān)注。

圖1 多不飽和脂肪酸的合成途徑Fig.1 Pathways of polyunsaturated fatty acid synthsis. The common Δ6pathway is indicated by solid arrows and the alternate Δ8pathway is indicated by hollow arrows. Des: desaturase; elo: elongase; SA: Stearic acid; OA: Oleic acid; LA: Linoleic acid; ALA:α-linolenic acid; STA: stearidonic acid; ETA: eicosatetraenoic acid; EDA: ω6-eicosadienoic acid; EtrA: ω3-eicosatrienoic acid; ETA:eicosatetraenoic acid; GLA: γ-linolenic acid; DGLA: dihomo-γ-linolenic acid: ARA: arachidonic acid; EPA: eicosapentaenoic acid.

多不飽和脂肪酸的代謝從硬脂酸 (Stearic acid，SA) 開(kāi)始，經(jīng)過(guò)一系列的脫氫和延長(zhǎng)反應(yīng)，形成各種不同的PUFAs，主要包括經(jīng)典的Δ6合成途徑和替代的Δ8合成途徑 (圖1)。Δ6合成途徑廣泛存在于微生物中，其關(guān)鍵酶 Δ6脫氫酶和 Δ6延長(zhǎng)酶及其基因已經(jīng)被廣泛克隆和研究。Δ8合成途徑主要存在于一些藻類微生物，其關(guān)鍵酶基因 Δ8脫氫酶基因和 Δ9延長(zhǎng)酶基因首先被Wallis等[6]和Qia等[7]分別從小眼蟲藻和球等鞭金藻中克隆出來(lái)，并在釀酒酵母中進(jìn)行了功能驗(yàn)證。Fraser等[8]用這2個(gè)基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥植物中重構(gòu)了Δ8合成途徑并且合成了ARA和EPA。但是，其他關(guān)于Δ8脫氫酶基因和Δ9延長(zhǎng)酶基因的報(bào)道卻很少。

ARA和EPA等人體必需的PUFAs在植物油中含量極低，主要從深海魚油中提取。由于資源匱乏，而且受季節(jié)、產(chǎn)地等因素的影響，魚油中的ARA、EPA等含量低且不穩(wěn)定，產(chǎn)品已經(jīng)不能滿足市場(chǎng)需求。雖然一些藻類的多不飽和脂肪酸 (PUFAs) 含量高[9]，但生物量低，培養(yǎng)條件對(duì)多不飽和脂肪酸的產(chǎn)量影響較大，產(chǎn)業(yè)化前景暗淡。大豆是我國(guó)主要的油料作物，如果能在大豆種子中合成 ARA和EPA，可以提高大豆油的品質(zhì)。Δ8-脂肪酸脫氫酶基因的克隆及其在釀酒酵母中的表達(dá)，不僅為生產(chǎn)含ARA和EPA的轉(zhuǎn)基因大豆奠定基礎(chǔ)；同時(shí)，不同Δ8-脂肪酸脫氫酶基因的克隆為研究多不飽和脂肪酸脫氫酶系的進(jìn)化關(guān)系提供了新的信息。

1 材料與方法

1.1 藻種、菌種和載體

小眼蟲藻Euglena gracilisFH277購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)；大腸桿菌Escherichia coliDH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；pGEM-T easy載體試劑盒購(gòu)自 Promega公司；表達(dá)載體pYES2.0和釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae營(yíng)養(yǎng)缺陷型INVSc1 (MATa his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATα his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52) 購(gòu)自 Invitrogen公司。

1.2 酶及試劑

限制酶BamH I、NotI、T4 DNA 連接酶、X-gal、IPTG購(gòu)自寶生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司；EDA、EtrA、DGLA和ETA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自 Cayman chemical公司；NP-40、CTAB購(gòu)自Sigma公司；DNA片段快速純化/回收試劑盒、氨芐青霉素和DNA marker III購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；TRNzol總RNA提取試劑購(gòu)自天根生化科技 (北京) 有限公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基參見(jiàn)文獻(xiàn)[10]，酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇 SC-Ura培養(yǎng)基和誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基的配制按照Invitrogen公司操作手冊(cè)進(jìn)行。小眼蟲藻養(yǎng)殖使用HUT培養(yǎng)基[6]。

1.4 引物設(shè)計(jì)、合成與序列測(cè)序

引物 (表1) 合成和序列測(cè)定均由上海生工完成。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

為了克隆Δ8-脂肪酸脫氫酶基因，根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的小眼蟲藻 Δ8-脂肪酸脫氫酶基因序列 (GenBank Accession No. AF139720) 設(shè)計(jì)引物 TEFDF、TEFDR，引物沒(méi)有引入限制性酶切位點(diǎn)。為了構(gòu)建表達(dá)載體pYEFD，根據(jù)克隆測(cè)序的EFD基因序列以及釀酒酵母表達(dá)載體pYES2.0的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物YEFDF、YEFDR，并分別被引入限制性酶切位點(diǎn)BamH I和XhoI (下劃線部分)。同時(shí)，為了能夠準(zhǔn)確識(shí)別翻譯起始密碼子和提高翻譯效率，在起始密碼子上游加入了酵母一致序列GCCACC。

1.5 小眼蟲藻Δ8-脂肪酸脫氫酶基因的克隆

將小眼蟲藻接種到150 mLHUT培養(yǎng)基中，22℃培養(yǎng)3 d，每天光照12 h，搖動(dòng)1～2次。5 000 r/min離心收集藻體，分別用TRNzol法提取小眼蟲藻的總RNA和 CTAB法提取小眼蟲藻的基因組 DNA。按照Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書，以小眼蟲藻總RNA為模板，以TEFDR為引物合成cDNA，凍存于?20℃?zhèn)溆谩?/p>

以TEFDF和TEFDR為引物，以小眼蟲藻基因組和總cDNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性40s，55℃退火30s，72℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用凝膠回收試劑盒回收，然后連接到pGME-T easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，先通過(guò)菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，然后將陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，最后將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送上海生工測(cè)序。重復(fù)3次。

1.6 表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與Δ8-脂肪酸脫氫酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)

以測(cè)序正確Δ8-脂肪酸脫氫酶基因ORF為模板，以YEFDF、YEFDR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pYES2.0分別用BamH I和XhoI雙酶切，將目的片段回收之后連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，大腸桿菌感受態(tài)準(zhǔn)備和轉(zhuǎn)化方法參考文獻(xiàn)[10]。篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過(guò)PCR和酶切檢測(cè)，得到重組質(zhì)粒pYEFD。將質(zhì)粒pYES2.0和pYEFD電擊轉(zhuǎn)化到營(yíng)養(yǎng)缺陷型釀酒酵母INVSc1中，在SC-Ura 培養(yǎng)基上篩選得到轉(zhuǎn)化子，分別作為對(duì)照菌株和工程菌株YD8。釀酒酵母電擊轉(zhuǎn)化方法和質(zhì)粒提取方法參考文獻(xiàn)[11]。

將對(duì)照菌株和工程菌株YD8接種到100 mL三角瓶裝有15 mL的SC-Ura的液體培養(yǎng)基中，在30℃和180 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)，將過(guò)夜培養(yǎng)物接種到250 mL三角瓶裝有50 mL含有1% NP40和2%的半乳糖的SC-Ura誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，使OD600達(dá)到0.4，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加終濃度為0.1 mol/L的底物EDA和EtrA。22℃和180 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，收獲菌體。

1.7 脂肪酸提取及甲酯化

將收獲的菌體用去離子水洗滌 3次，50℃烘干10 h后，磨碎。加入5% KOH-CH3OH溶液，70℃反應(yīng)2 h，之后加入14% BF3-CH3OH，70℃反應(yīng)1 h，合成脂肪酸甲酯。利用1∶4的氯仿：正己烷萃取脂肪酸甲酯，用氮?dú)獯蹈?，正己烷回溶，備用待測(cè)。

1.8 脂肪酸甲酯的氣相色譜分析

氣相色譜分析采用彈性石英毛細(xì)管柱，載氣為N2，線速8 cm/s。分流比100:1，氣化溫度280℃，柱溫240℃，尾吹32 mL/min，檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器，上樣量2 μL。

1.9 轉(zhuǎn)化率的計(jì)算方法

轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)物所占總脂肪酸的含量/(產(chǎn)物所占總脂肪酸的含量+底物所占總脂肪酸的含量)×100%。重復(fù)試驗(yàn)3次，求平均值。

2 結(jié)果

2.1 Δ8-脂肪酸脫氫酶基因克隆與序列分析

提取小眼蟲藻的總RNA，并以TEFDR為引物反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，再提取小眼蟲藻的基因組，分別以 cDNA和基因組 DNA為模板，以 TEFDF和TEFDR為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，都得到了約1.2 kb的片段 (圖2)。將2個(gè)片段分別連接到pGEM-T easy載體上構(gòu)建成載體pTEFD和pTEFDm，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：2種方式克隆的片段均為 1 266 bp，是一個(gè)完整的ORF，共編碼 421個(gè)氨基酸；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，該基因沒(méi)有內(nèi)含子。該基因序列已經(jīng)提交到 GenBank(Accession No. GU812432)。已經(jīng)報(bào)道的小眼蟲藻Δ8-脂肪酸脫氫酶基因序列 (GenBank Accession No.AF139720) 所編碼的脫氫酶被定義為 EFD1，所以將我們克隆的小眼蟲藻 Δ8-脂肪酸脫氫酶基因序列所編碼的脫氫酶定義為EFD2。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis analysis of PCR product. M: DNA marker Ⅲ; 1: cDNA PCR; 2: genome DNA PCR.

efd1基因?yàn)? 260 bp，編碼419個(gè)氨基酸，比efd2短6 bp、2個(gè)氨基酸。利用軟件DNAMAN對(duì)efd1和efd2進(jìn)行比較，兩者核苷酸相似性98.5%，氨基酸相似性 96.4%。由圖 3可以看出，EFD1和EFD2的主要區(qū)別在于 N端氨基酸殘基不同，后面雖然也有 6個(gè)氨基酸殘基不一樣，但是，3個(gè)典型的組氨酸模體 (Motif) HXXXHH、HXXHH和QXXHH和一個(gè)細(xì)胞色素 b5樣的結(jié)構(gòu)域卻沒(méi)有改變，具有典型的脂肪酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)特征。

2.2 表達(dá)載體pYEFD的構(gòu)建與鑒定

將以載體pTEFD為模板，以YEFDF、YEFDR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物和載體pYES2.0分別用BamH I和XhoI雙酶切，回收連接之后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，從含有Amp的LB平板上隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子，小量提取質(zhì)粒，分別通過(guò)PCR和酶切驗(yàn)證 (圖4)，最后將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送上海生工測(cè)序，序列與閱讀框架正確，表明表達(dá)載體 pYEFD構(gòu)建成功。

圖3 EFD1和EFD2氨基酸序列比較Fig.3 Alignment of amino acid sequences of EFD1 and EFD2.

2.3 Δ8-脂肪酸脫氫酶基因誘導(dǎo)表達(dá)

將空載體pYES2.0和表達(dá)載體pYEFD電擊轉(zhuǎn)化到釀酒酵母缺陷型INVSc1中，在SC-Ura平板上篩選到轉(zhuǎn)化空載體的對(duì)照菌株和轉(zhuǎn)化 pYEFD的工程菌株YD8。對(duì)照菌株和工程菌株先接種在碳源為蔗糖的SC-Ura培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)接到碳源為半乳糖并添加有底物 EDA和 EtrA誘導(dǎo)培養(yǎng)基中22℃培養(yǎng)72 h，收集菌體，提取脂肪酸并甲酯化后進(jìn)行氣相色譜分析，結(jié)果如圖5所示。圖5A標(biāo)準(zhǔn)品 EDA、DGLA、EtrA和 ETA，出峰時(shí)間分別為21.337 min、22.301 min、23.544 min 和 24.669 min。圖5B為轉(zhuǎn)化了空載體 pYES2.0的對(duì)照菌株，由于加入了底物EDA和EtrA，所以在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)了底物峰。圖5C為轉(zhuǎn)化了pYEFD的工程菌株YD8。與圖5B對(duì)比，除了相應(yīng)位置的底物峰而外，還出現(xiàn)了DGLA和ETA的產(chǎn)物峰。說(shuō)明EDA經(jīng)過(guò)Δ8脫氫轉(zhuǎn)變成DGLA，EtrA經(jīng)過(guò)Δ8脫氫轉(zhuǎn)變成ETA，也說(shuō)明克隆的EFD2基因產(chǎn)物具有位置專一的Δ8-脂肪酸脫氫酶活性。經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算，轉(zhuǎn)化菌株YD8中的DGLA和ETA分別占總脂肪酸含量的8.32%和9.24%，底物EDA和EtrA轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了31.2%和46.3%。

圖4 重組質(zhì)粒pYEFD的鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid pYEFD. 1: PCR product of pYEFD; 2: pYES2.0 digested withBamH I andXhoI; 3: pYEFD digested with byBamH I andXhoI; 4: DNA marker Ⅲ.

圖5 釀酒酵母總脂肪酸氣相色譜分析圖Fig.5 GC analysis of fatty acid methyl esters of total lipids ofS. cerevisiaegrown under inducing conditions. (A) Standard of EDA, DGLA, EtrA and ETA. (B) INVSc1 transformed with pYES2.0. (C) INVSc1 transformed with pYPTD5.

3 討論

Δ8途徑和 Δ6途徑的主要區(qū)別是 Δ8途徑是先經(jīng)過(guò) Δ9-延長(zhǎng)酶催化延長(zhǎng) 2個(gè)碳原子后再在 Δ8位脫氫形成 20碳的多不飽和脂肪酸，因此 Δ8途徑的關(guān)鍵酶是Δ9-延長(zhǎng)酶和Δ8-脫氫酶；Δ6途徑是先在Δ6位脫氫后再經(jīng)過(guò) Δ6-延長(zhǎng)酶催化延長(zhǎng) 2個(gè)碳原子形成 20碳的多不飽和脂肪酸，因此 Δ6-脫氫酶催化 Δ6位脫氫是該途徑的限速步驟。小眼蟲藻是單細(xì)胞的裸藻，由于缺乏 Δ6-脫氫酶，是通過(guò) Δ8途徑合成并積累大量的多不飽和脂肪酸。目前，Δ8途徑主要存在于原生動(dòng)物Tetrahymena pyriformis、變形蟲Acanthamoebasp.、眼蟲藻和金藻。但是目前只有眼蟲藻Δ8-脫氫酶基因已被克隆，因此，新的Δ8-脫氫酶基因的克隆為研究多不飽和脂肪酸脫氫酶系的進(jìn)化關(guān)系提供了新的信息。

所有鑒定的脂肪酸脫氫酶都有幾個(gè)短且高度保守的區(qū)域：即3個(gè)組氨酸模體HXXXHH、HXXHH和 HXXHH，這 3個(gè)組氨酸模體及其相對(duì)位置對(duì)于酶活性是必需的。Δ5-和Δ6-脫氫酶的N-末端還有一個(gè)細(xì)胞色素b5樣的結(jié)構(gòu)域，這時(shí)脫氫酶的第3個(gè)組氨酸模體就變成QXXHH[12]。我們克隆的Δ8-脫氫酶N-末端包含一個(gè)細(xì)胞色素 b5樣的結(jié)構(gòu)域和改變了的第3個(gè)組氨酸模體QXXHH，說(shuō)明Δ8-脫氫酶在結(jié)構(gòu)上是和Δ5-和Δ6-脫氫酶一致的。我們進(jìn)行了3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，克隆的 Δ8-脫氫酶基因的氨基酸序列與文獻(xiàn)報(bào)道的 Δ8-脫氫酶基因的氨基酸序列相似性為96.4%，其組氨酸模體和細(xì)胞色素b5樣結(jié)構(gòu)域完全一致，主要是細(xì)胞色素 b5樣結(jié)構(gòu)域之前的 N-末端序列不同。我們還試圖從小眼蟲藻FH849和FH850(均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)) 中克隆Δ8-脫氫酶基因，無(wú)論是以基因的5′和3′末端還是以保守區(qū)域組氨酸模體和/或細(xì)胞色素 b5樣結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物，都沒(méi)有克隆出Δ8-脫氫酶基因 (數(shù)據(jù)未顯示)，這說(shuō)明，不同小眼蟲藻的Δ8-脫氫酶基因序列不同，甚至相差很大，而且，Δ8-脫氫酶基因序列可能還反映出不同小眼蟲藻的進(jìn)化及親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

由于釀酒酵母缺乏內(nèi)源的多不飽和脂肪酸，因此釀酒酵母成為鑒定多不飽和脂肪酸脫氫酶和延長(zhǎng)酶活性及其底物專一性的理想宿主[6-7,13]。當(dāng)我們?cè)谂囵B(yǎng)基中添加底物EDA和EtrA誘導(dǎo)釀酒酵母工程菌YD8表達(dá)EFD2時(shí)，有產(chǎn)物DGLA和ETA生成，由于工程菌缺乏內(nèi)源的DGLA和ETA，說(shuō)明是EDA經(jīng)過(guò)Δ8脫氫轉(zhuǎn)變成DGLA，EtrA經(jīng)過(guò)Δ8脫氫轉(zhuǎn)變成ETA，說(shuō)明EFD2基因產(chǎn)物具有Δ8-脂肪酸脫氫酶活性；同樣，當(dāng)我們?cè)谂囵B(yǎng)基中添加底物L(fēng)A和ALA誘導(dǎo)釀酒酵母工程菌YD8表達(dá)EFD2時(shí)，卻沒(méi)有新的產(chǎn)物生成 (數(shù)據(jù)未顯示)，說(shuō)明 EFD2基因產(chǎn)物具有位置專一的Δ8-脂肪酸脫氫酶活性。

Δ8-脂肪酸脫氫酶克隆對(duì)于用 Δ8途徑生產(chǎn)多不飽和脂肪酸具有重要意義。已經(jīng)有研究者將該途徑引入到擬南芥中并且成功合成了ARA和EPA[8]。大豆是我國(guó)最主要的油料作物，含有豐富的Δ8途徑底物L(fēng)A和ALA，如果在大豆中重構(gòu)Δ8途徑，就可以在大豆種子中合成 ARA和 EPA，提高大豆油的品質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆了大豆種子特異性啟動(dòng)子BCSP952[14]、Δ9-脂肪酸延長(zhǎng)酶 ASE2 (結(jié)果另文發(fā)表) 基因和 Δ5-脂肪酸脫氫酶基因[15]，為大量合成ARA和EPA的轉(zhuǎn)基因大豆提供了參考。

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Cloning of Δ8-fatty acid desaturase gene fromEuglena gracilisand its expression inSaccharomyces cerevisiae

Ming Li1,2, Xiuyuan Ou1, Dongsheng Wei1, Xiangdong Yang3, Dongquan Guo3, Xueyan Qian3,Laijun Xing1, and Mingchun Li1

1Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology,Ministry of Education,Department of Microbiology,Nankai University,Tianjin
300071,China
2Key Laboratory of Industrial Microbiology,Ministry of Education,School of Bioengineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin300457,China
3Biotechnology Research Center,Jilin Academy of Agriculture Sciences,Changchun130033,China

Received:February 8, 2010;Accepted:May 17, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30771355), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA10Z189), Research Fund for the New Teacher Doctoral Programe of Ministry of Education of China (No.20070055061).

Corresponding author:Mingchun Li. Tel: +86-22-23508506; Fax: +86-22-23508800; E-mail: nklimingchun@yahoo.com.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 30771355)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2007AA10Z189)，教育部博士點(diǎn)基金新教師項(xiàng)目 (No. 20070055061)資助。