馬蘭青，師光祿，葉和春，劉本葉，王有年

1 北京農(nóng)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè) (北方) 重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

2 中國(guó)科學(xué)院植物研究所 中國(guó)科學(xué)院光合作用與環(huán)境分子生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093

綜 述

植物類型III聚酮合酶超家族基因結(jié)構(gòu)、功能及代謝產(chǎn)物

馬蘭青1，師光祿1，葉和春2，劉本葉2，王有年1

1 北京農(nóng)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè) (北方) 重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

2 中國(guó)科學(xué)院植物研究所 中國(guó)科學(xué)院光合作用與環(huán)境分子生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093

植物聚酮類化合物主要包括酚類、芪類及類黃酮化合物等，在植物花色、防止紫外線傷害、預(yù)防病原菌、昆蟲(chóng)危害以及作為植物與環(huán)境互作信號(hào)分子方面行使著重要的生物學(xué)功能。該類化合物具有顯著多樣的生物學(xué)活性，對(duì)人體保健及疾病治療有顯著意義。植物類型III 聚酮化合物合酶 (PKS) 在該類化合物生物合成起始反應(yīng)中行使著關(guān)鍵作用，決定該類化合物基本分子骨架建成和代謝途徑碳硫走向，為合成途徑關(guān)鍵酶和限速酶。以查爾酮合酶為原型酶的植物類型III PKS超家族是研究系統(tǒng)進(jìn)化和蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的模式分子家族，目前已經(jīng)分離得到14種植物類型IIIPKS基因，這些同祖同源基因及其表達(dá)產(chǎn)物既有共性，也表現(xiàn)出許多獨(dú)特個(gè)性，這些個(gè)性賦予此類次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)上的多樣性。以下綜述了植物類型III PKS超家族基因結(jié)構(gòu)、功能及代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展。

聚酮合酶，查爾酮合酶，次生代謝

Abstract:Plant-specific type III polyketide synthase (PKS) produces a variety of plant secondary metabolites with notable structural diversity and biological activity. So far 14 plant-specific type III PKS have been identified according to their enzymatic products, and the corresponding genes have been cloned and characterized. The differences among the various PKS are mainly in their substrate specificities, the number of their condensation reactions, and the type of ring closure of their products. However,numerous studies have revealed the common features among the plant-specific type III PKS, which include sequence homology,similar gene structure, conserved amino acid residues in the reaction center, enzymatic characteristics and reaction mechanism. We briefly reviewed 14 plant-specific type III PKS to better understand genetic and metabolic engineering of plant-specific type III PKS.

Keywords:polyketide synthase, chalcone synthase, secondary metabolism

聚酮類化合物 (Polyketide，PK) 是由細(xì)菌、真菌、放線菌及植物產(chǎn)生的一大類次生代謝產(chǎn)物，主要包括大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、蒽環(huán)類、聚醚類、酚類、芪類以及類黃酮化合物等。由于生物合成途徑及機(jī)制復(fù)雜多變，造成聚酮化合物數(shù)量和分子結(jié)構(gòu)極其龐大繁雜，從而使該類化合物具有顯著多樣的生物學(xué)活性。微生物來(lái)源的聚酮化合物家族包括了大多數(shù)抗生素和一些重要藥物 (抗癌藥、免疫抑制劑等)。如臨床上已經(jīng)應(yīng)用的紅霉素、四環(huán)素、利福霉素、兩性霉素、阿霉素、洛伐他丁、FK506、雷帕霉素等重要抗生素，以及農(nóng)牧業(yè)上使用的阿弗菌素和莫能星、泰樂(lè)菌素等都屬于這個(gè)家族[1]。植物聚酮類化合物主要包括酚類、芪類以及類黃酮化合物等，其中，眾多化合物具有抗腫瘤、心血管保護(hù)、抗氧化功能[2-3]。目前，來(lái)源于聚酮化合物的藥物每年銷售額已超過(guò)100億美元。

聚酮化合物雖然種類繁多、結(jié)構(gòu)多變，但其生物合成有著共同的機(jī)制，均由聚酮化合物合酶(Polyketide synthase，PKS) 催化合成。目前發(fā)現(xiàn)的PKS大體上可分為3類：I型PKS是以模塊形式存在的多功能酶，每一模塊含有一套獨(dú)特的、非重復(fù)使用的催化功能域，主要催化合成大環(huán)內(nèi)酯、聚烯及聚醚類化合物；II型PKS是含有一組可重復(fù)使用單元的多酶復(fù)合體，主要催化芳香族聚酮化合物的生物合成，I型和II型PKS主要存在于微生物中；III型PKS屬于查爾酮合成酶 (Chalcone synthase，CHS) (EC 2.3.1.74) 類，主要存在于植物和細(xì)菌中，是一種可重復(fù)使用的同源雙亞基蛋白，主要負(fù)責(zé)單環(huán)或雙環(huán)芳香類聚酮化合物的生物合成[1]。本文主要針對(duì)植物類型III PKS超家族基因結(jié)構(gòu)、功能及代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1 植物類型III PKS超家族成員

CHS普遍存在于植物中。1972年，CHS的體外酶促活性首次在歐芹懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中被發(fā)現(xiàn)[4]。1983年首個(gè)CHS的基因序列從歐芹中被克隆[5]。漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，CHS基因在不同植物譜系中發(fā)生了不同程度的重復(fù)和分化，導(dǎo)致在多數(shù)植物基因組中存在具不同表達(dá)特性的CHS重復(fù)基因，并在部分植物基因組中出現(xiàn)由CHS基因分化形成的具有新的底物選擇性和產(chǎn)物特異性的“類CHS(CHS-Like)”基因[6]。這些結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)、但表達(dá)模式及編碼產(chǎn)物催化特性有一定差異的基因組成了一個(gè)龐大的基因家族——查爾酮合酶基因超家族 (Chalcone synthase superfamily)，又稱為植物類型III PKS基因超家族 (Plant-specific type III polyketide synthase superfamily)。

目前，已經(jīng)從苔蘚、蕨類、裸子和被子植物中分離了14種植物類型IIIPKS基因。這些不同PKS的差別主要體現(xiàn)在起始底物特異性、縮合反應(yīng)次數(shù)(聚酮鏈延伸長(zhǎng)度) 以及產(chǎn)物合成所使用的不同環(huán)化方式等。這些PKS的名稱、催化方式見(jiàn)表1。以細(xì)菌類型III PKS為外類群的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，植物類型III PKS按照苔蘚、蕨類，裸子和被子植物分類，每一類型植物中的 CHSs和功能異化的類型III PKS (CHS-like) 分別構(gòu)成獨(dú)立的組群 (圖1)[10]。

2 植物類型III PKS超家族基因結(jié)構(gòu)

植物類型 III PKS超家族不同成員具有許多共同特征，主要包括基因結(jié)構(gòu)、序列相似性、活性中心、酶學(xué)性質(zhì)以及共同的催化機(jī)制等[6-7]。保守的基因結(jié)構(gòu)是高等植物類型IIIPKS的一個(gè)共同特征。顯花植物 (裸子植物和被子植物) 中，除一個(gè)早期報(bào)道的金魚(yú)草Antirrhinum majusCHS(AMCHS) 含有2個(gè)內(nèi)含子 (Intron) 外[7]，迄今20余年研究中，所有報(bào)道的類型IIIPKS基因均含有1個(gè)內(nèi)含子且該內(nèi)含子位置保守[3,8]。金魚(yú)草AMCHS兩個(gè)內(nèi)含子中，第一內(nèi)含子的位置與其他基因相同，第二內(nèi)含子位于第二個(gè)外顯子 (Exon) 內(nèi)部，Sommer和 Saedler[7]推測(cè)第二內(nèi)含子是在金魚(yú)草這一物種形成后獲得的。然而作者及后續(xù)的研究并未對(duì)AMCHS的基因特性、表達(dá)特性及 AMCHS酶學(xué)性質(zhì)，具體功能作進(jìn)一步的研究，也沒(méi)有金魚(yú)草及其相關(guān)科屬植物中類型IIIPKS超家族其他成員基因結(jié)構(gòu)方面的報(bào)道。

有趣的是，在我們工作中2個(gè)含有3個(gè)內(nèi)含子的類型IIIPKS基因 (PcPKS1，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能研究證明其編碼產(chǎn)物為具有雙酶活性的 CHS；PcPKS2，經(jīng)過(guò)分析確認(rèn)其編碼產(chǎn)物為苯亞甲基丙酮合酶，Benzalacetone synthase，BAS) 相繼從虎杖Polygonum cuspidatumSieb. et Zucc中被分離和鑒定，3個(gè)內(nèi)含子在上述 2個(gè)基因中的插入位置完全保守[9-10]。與PcPKS1和PcPKS2內(nèi)含子2相比，金魚(yú)草AMCHS第二個(gè)內(nèi)含子的插入位置相對(duì)保守，向前移動(dòng)了一個(gè)堿基[9-10]。PcPKS1和PcPKS2的 3個(gè)內(nèi)含子之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的相似性[9-10]。迄今為止，CHS是高等植物中最共同和分布最廣泛的類型IIIPKS，所有已經(jīng)得到功能驗(yàn)證的植物類型IIIPKS超家族其他成員 (CHS-like) 都來(lái)自于CHS廣泛重復(fù)和后續(xù)的遺傳變異[2]。除了PcPKS1和PcPKS2，我們進(jìn)一步的工作發(fā)現(xiàn)在虎杖中存在一個(gè)含有 1～2個(gè)內(nèi)含子基因組成的植物類型IIIPKS基因家族。其中包括一個(gè)單內(nèi)含子CHS基因 (EU647246)、一個(gè)單內(nèi)含子CHS-like基因 (DQ459349)、一個(gè)雙內(nèi)含子CHS-like基因 (EU647245)?？紤]到PcPKS1和PcPKS23個(gè)內(nèi)含子保守的插入位點(diǎn)以及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果 (圖 1)，我們推測(cè)虎杖中PcPKS2極有可能通過(guò)一個(gè)單基因重復(fù)事件從一個(gè) 3內(nèi)含子CHS(PcPKS1) 進(jìn)化而來(lái)[10]。隱花植物中，新近一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)了植物類型IIIPKS超家族特殊的基因結(jié)構(gòu)，新型模式植物小立碗蘚Physcomitrella patens假定的19個(gè)類型 IIIPKS基因中，有 6個(gè)不含內(nèi)含子，4個(gè)含有1個(gè)內(nèi)含子，而剩余的基因含有2個(gè)內(nèi)含子[11]。苔蘚植物大約在 4.5億年前從維管植物的祖先中分離出來(lái)[11]，因此類型IIIPKS非正常的基因結(jié)構(gòu)在顯花植物和隱花植物中都是存在的。植物β-酮酯酰合酶 (β-ketoacyl synthases，KS) 被認(rèn)為是植物類型 III PKS的祖先，大部分的β-酮酯酰合酶在其編碼區(qū)不含內(nèi)含子[12]。目前，還沒(méi)有類型IIIPKS基因內(nèi)含子功能方面的報(bào)道。然而一些研究表明，內(nèi)含子對(duì)于植物基因的功能是有作用的[13]。近些年來(lái)，雖然類型III PKS的家族成員不斷從各種植物中被鑒定，但對(duì)該家族基因的基因組分布狀況知之甚少。植物類型 III PKS在基因組水平上復(fù)雜的進(jìn)化變化極有可能是不斷適應(yīng)產(chǎn)生具有植物種屬特性化學(xué)信號(hào)的結(jié)果。因此非正常的基因結(jié)構(gòu)也極有可能存在于那些已經(jīng)經(jīng)過(guò)功能鑒定的類型 IIIPKS超家族其他成員(CHS-like) 基因中。進(jìn)一步的工作需要闡明植物類型 IIIPKS多內(nèi)含子基因結(jié)構(gòu)在高等植物中的分布狀況。

表1 植物類型III PKSs超家族成員Table 1 Plant-specific type III polyketide synthase superfamily

圖1 植物類型III PKS超家族成員系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果 (以細(xì)菌類型III PKS為外類群，用于系統(tǒng)發(fā)育分析的基因序列接收號(hào)及分析方法見(jiàn)文獻(xiàn)[10])Fig.1 Neighbor-joining tree of type III PKS. Numbers at the forks are bootstrap values from 100 replicates. Four bacterial type III PKS were used to root the tree. The accession numbers used in the analysis were as previously described[10].

3 植物類型III PKS超家族酶功能及其次生代謝產(chǎn)物

植物類型 III PKS超家族成員底物選擇和催化機(jī)制非常復(fù)雜，主要體現(xiàn)在 3個(gè)方面：一是超家族中不同酶有不同的主產(chǎn)物；二是家族中的很多成員都有著非常寬泛的起始底物特異性；三是體外酶促反應(yīng)中，會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的早期脫軌產(chǎn)物——副產(chǎn)物，如 2步縮合反應(yīng)丙烯酮-中間體副產(chǎn)物Bisnoryangonin (BNY)，3步縮合反應(yīng)丁烯酮-中間體副產(chǎn)物4-Coumaroyltriaceticacid lactone (CTAL)，在特定條件下，副產(chǎn)物的量有時(shí)會(huì)超過(guò)主產(chǎn)物的量。植物聚酮類化合物主要包括酚類、芪類以及類黃酮化合物等。其中，大部分聚酮類化合物生物合成途徑機(jī)制尚不明確，但可以肯定的是植物類型III PKS在聚酮化合物生物合成起始反應(yīng)中行使著關(guān)鍵的作用，決定著化合物基本分子骨架的建成和代謝途徑碳硫走向，是植物聚酮化合物生物合成途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。作為重要的植物次生代謝產(chǎn)物，植物聚酮類化合物及其衍生物在植物色彩、防止紫外線傷害、預(yù)防病原菌、昆蟲(chóng)危害以及作為植物與環(huán)境之間互作的重要信號(hào)分子方面行使著重要的生物學(xué)功能。

植物類型III PKS超家族中，目前研究最為透徹的是查爾酮合酶，其催化來(lái)自丙二酰輔酶 A(Malonyl-CoA) (類型III PKS“延伸”底物) 的3個(gè)乙酰集團(tuán)通過(guò)連續(xù)的縮合反應(yīng)連接到 4-香豆酰輔酶A (p-Coumaroyl-CoA) (類型 III PKS“起始”底物) 分子上，之后通過(guò)克萊森 (Claisen) 型環(huán)化反應(yīng)生成芳香族聚酮化合物柚皮素查爾酮 (Naringenin chalcone)，其為類黃酮化合物生物合成的前體(圖 2) 。類黃酮化合物廣泛存在于高等植物中，在植物體內(nèi)絕大部分以糖甙的形式轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存[14]，與植物的花色形成密切相關(guān)，并在植物與環(huán)境的相互作用中起重要作用，如防止紫外線 (UV) 損傷、抗蟲(chóng)、抗病、影響豆科植物的根瘤形成等[2-3]。眾多研究結(jié)果表明，查爾酮衍生物 (即類黃酮化合物) 對(duì)人體健康和疾病治療具有積極效果[2-3]。

植物類型 III PKS超家族的酶都是由分子量為40～45 kDa大小適中亞基組成的同型二聚體，活性位點(diǎn)為 Cys164、His303和 Asn336，這 3個(gè)在植物類型 III PKS超家族中絕對(duì)保守的氨基酸組成了該類酶的活性中心 (三聯(lián)體活性中心)：“起始底物分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域”和“環(huán)化反應(yīng)結(jié)構(gòu)域”。紫花苜蓿Medicago sativaCHS晶體結(jié)構(gòu)和定點(diǎn)突變的研究結(jié)果揭示了CHS催化柚皮素查爾酮形成機(jī)制和過(guò)程：1) 起始分子定位于 Cys164位點(diǎn)；2) 丙二酰-CoA脫羧生成乙酰-CoA；3) 聚酮化合物鏈開(kāi)始延伸；4)丁烯酮-中間體-CHS復(fù)合物完成環(huán)化和芳構(gòu)化[15]。此外，CHS活性位點(diǎn)還包括Val98、Thr132、Ser133、Met137、Gly163、Thr194、Gly211、Gly216、Ile254、Ser338、Pro375，以及CHS“門衛(wèi)”氨基酸Phe215和 Phe265[2]。植物類型 III PKS超家族其他成員酶(CHS-Like) 功能的多樣性來(lái)自原型酶——CHS活性位點(diǎn)的小的修飾，這些小的變動(dòng)改變了起始底物的選擇性、鏈延伸的長(zhǎng)度和環(huán)化反應(yīng)機(jī)制 (表1、圖2)。

3.1 苯亞甲基丙酮合酶 (BAS)

苯亞甲基丙酮合酶 (BAS) 使用與CHS相同的底物，但產(chǎn)物卻存在很大差異。掌葉大黃Rheum palmatumBAS一個(gè)顯著特點(diǎn)是 Phe215 (M. sativaCHS順序)被Leu取代，定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這個(gè)位置上的取代對(duì)于該酶的BAS活性是必需的，該位置上 Phe被替換，致使聚酮鏈的延伸在乙烯酮中間體階段即被打斷 (表1、圖2)[16]。Austin和Noel[2]認(rèn)為CHS“門衛(wèi)”Phe、Phe215和Phe265可能調(diào)節(jié)類型III PKS活性位點(diǎn)與輔酶A (CoA) 結(jié)合通道之間的空間結(jié)構(gòu)。我們的研究證實(shí)，PcPKS2同樣是一個(gè) BAS，有趣的是，Phe215和 Phe265在 PcPKS2中雙雙缺失，分別被Leu和Cys取代，導(dǎo)致聚酮鏈的延伸在乙烯酮中間體階段提前結(jié)束 (圖2)。另一個(gè)非常有趣的結(jié)果同樣出現(xiàn)在我們的研究中，經(jīng)序列及系統(tǒng)發(fā)育分析表明，PcPKS1是一個(gè)典型的CHS，然而，功能和酶學(xué)分析結(jié)果顯示 PcPKS1是一個(gè)同時(shí)擁有 CHS和 BAS活性的雙功能酶，且PcPKS1的 BAS活性催化效率 (Kcat/Km) 比PcPKS2高70倍[10]。BAS在構(gòu)建具有重要藥理價(jià)值一系列苯丁烷類化合物 (Phenylbutanoids) 及其衍生物的 C6–C4分子骨架方面具有重要的功能。目前這些苯丁烷類化合物主要包括大黃中的林氏蓮花掌素甙 (Glucoside lindleyin)、生姜中的姜酚(Gingerol) 和姜黃 (Curcumin)[17]，以及覆盆子果實(shí)中一種獨(dú)特的芳香物質(zhì)覆盆子酮 (Raspberry ketone)[17]。

3.2 4-香豆酰甘油酸合酶 (CTAS)

八仙花Hydrangea macrophyllavar.thunbergii4-香豆酰甘油酸合酶 (p-Coumaroyl triacetic acid synthase，CTAS) 催化4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A分子間3步連續(xù)的縮合反應(yīng)，但CTAS缺乏必要的環(huán)化機(jī)制，導(dǎo)致其催化產(chǎn)物為線性丁烯酮中間體副產(chǎn)物——CTAL[18](表1、圖2)。序列分析顯示，在CTAS中，CHS活性位點(diǎn)Thr197被Asp取代，同時(shí)在相當(dāng)于M. sativaCHS第290位氨基酸殘基位置上有6個(gè)氨基酸殘基的插入[2]。CTAS產(chǎn)物CTAL的衍生物Hydramacroside B存在于八仙花葉片中，是一種重要的植物抗毒素[19]。

3.3 芪合酶 (STS)

芪合酶 (Stilbene synthase，STS) 能夠利用與CHS相同的底物催化合成相同的丁烯酮-中間體產(chǎn)物，然而后續(xù)步驟中，二者環(huán)化反應(yīng)機(jī)制存在差異，CHS運(yùn)用分子內(nèi)克萊森型縮合反應(yīng)機(jī)制催化丁烯酮-中間體分子C6和C1位置進(jìn)行縮合連接生成柚皮素查爾酮；而 STS則運(yùn)用分子內(nèi)醛醇縮合 (Aldol condensation) 反應(yīng)機(jī)制催化丁烯酮-中間體分子 C7和 C2位置進(jìn)行縮合連接生成白藜蘆醇(Resveratrol)，且伴有 C1位置脫羧反應(yīng) (表 1、圖2)。后續(xù)研究顯示，STS與CHS之間具有顯著的序列相似性[20]，除不同的環(huán)化反應(yīng)機(jī)制外，二者之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他反應(yīng)機(jī)制的差別[21]。隨著STS從松樹(shù)(裸子植物)[22]和葡萄 (被子植物)[23]相繼克隆促進(jìn)了STS與CHS之間的系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示二者在氨基酸水平存在60%～90%的同一性，在34個(gè)CHS和4個(gè)STS的系統(tǒng)發(fā)育分析中，STS沒(méi)有單獨(dú)聚合，而是與相同或相關(guān)植物的CHS聚合，該研究結(jié)果說(shuō)明 STS從 CHS多次進(jìn)化而來(lái)。有趣的是，將花生Arachis hypogaeaSTS和野葛Pueraria lobataCHS cDNA分別在大腸桿菌中表達(dá)，它們的表達(dá)產(chǎn)物存在著部分重疊，即在 CHS催化產(chǎn)物中有白藜蘆醇(約為柚皮素查爾酮的2.7%～4.2%)，而在STS催化產(chǎn)物中含有有柚皮素查爾酮 (約為白藜蘆醇量的1.4%～2.3%)[24]。被子植物STS產(chǎn)物白藜蘆醇是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，是在植物受到病原性進(jìn)攻和環(huán)境惡化時(shí)產(chǎn)生的一種植物抗毒素，廣泛存在于種子植物中?；ㄉ?、葡萄的STS在煙草、苜蓿中異源過(guò)表達(dá)后，上述兩種植物的抵抗真菌能力顯著增強(qiáng)[25]。白藜蘆醇不僅是一種重要的植物抗毒素，還具有眾多的藥理和保健功能，主要包括：抗癌作用；心血管保護(hù)作用；抗氧化、抗自由基作用；神經(jīng)保護(hù)作用；消炎作用；抗真菌作用；機(jī)體損傷的保護(hù)作用；植物雌激素作用；對(duì)骨代謝和內(nèi)皮素拮抗劑的影響等。其中，最令人矚目和具有發(fā)展前景的是其在抗腫瘤、心血管保護(hù)、抗氧化方面的作用[26]。裸子植物 STS由于使用不同的起始底物肉桂酰輔酶A (Cinnamoyl-CoA)，其產(chǎn)物為銀松素 (Pinosylvin)，也是一種重要的植物抗毒素。

3.4 聯(lián)芐合酶 (BBS)

聯(lián)芐合酶 (Bibenzyl synthase，BBS) 的催化方式與STS完全相同，只是起始底物有所差異。BBS使用聯(lián)芐-m-香豆酰輔酶 A (dihydro-m-Coumaroyl-CoA) 為起始底物，催化來(lái)自丙二酰輔酶A的3個(gè)乙酰集團(tuán)通過(guò)連續(xù)的縮合反應(yīng)連接到起始底物分子上，并運(yùn)用分子內(nèi)醛醇縮合反應(yīng)機(jī)制催化中間體分子 C7和 C2位置進(jìn)行縮合連接生成聯(lián)芐-芪產(chǎn)物(Dihydrostilbene)——3,3'5-Trihydroxybibenzyl，且伴有 C1位置脫羧反應(yīng) (表 1、圖 2)[27]。基于 BBS序列結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CHS保守位點(diǎn) Met137、Val98和Gly211分別被Leu、Ala和Thr取代有可能直接影響B(tài)BS起始底物的選擇性[2]。在脅迫或傷處理蘭花組織時(shí)，特別是傷口感染內(nèi)生菌根菌的情況下，聯(lián)芐-芪類化合物及其三環(huán)衍生物——9,10-Dihydrophenanthrenes開(kāi)始大量積累，推測(cè)聯(lián)芐化合物為一種植物抗真菌植保素[2]。

3.5 芪-羧酸酯合酶 (STCS)

芪-羧酸酯類化合物存在于八仙花屬(Hydrangea)、苔類 (Liverworts)、大麻類植物(Cannabis) 以及毒常春藤 (Poison ivy) 中，它們中的許多化合物擁有非常有價(jià)值的特性，如葉甜素(Phyllodulcin) 的甜味超過(guò)蔗糖600～800倍[28]。從該類化合物分子結(jié)構(gòu)判斷，其前體極有可能起源于類型III PKS的催化，然而在體外環(huán)境下，至今沒(méi)有該類化合物完整的合成途徑得到確認(rèn)和證明[2]。但在上述植物中，不斷有催化該類反應(yīng)新的類型III PKS被驗(yàn)證。例如，八仙花Hydrangea macrophylla芪-羧酸酯合酶 (Stilbenecarboxylate synthase，STCS)的催化方式與STS、BBS的差別主要體現(xiàn)在最適起始底物和脫羧反應(yīng)機(jī)制上，STCS以聯(lián)芐-4-香豆酰輔酶A (Dihydro-4-Coumaroyl-CoA) 為起始底物，催化來(lái)自丙二酰輔酶A的3個(gè)乙酰集團(tuán)通過(guò)連續(xù)的縮合反應(yīng)連接到起始底物分子上，并運(yùn)用分子內(nèi)醛醇縮合反應(yīng)機(jī)制催化中間體分子C7和C2位置進(jìn)行縮合連接生成5-Hydroxylunularic acid，值得關(guān)注的是，其C1位置未發(fā)生脫羧反應(yīng) (表1、圖2)[29]。

3.6 吖啶酮合酶 (ACS)

蕓香科植物 (Rutaceae) 具有三環(huán)結(jié)構(gòu)吖啶酮分子的基本骨架是由吖啶酮合酶 (Acridone synthase ACS) 催化合成的。ACS催化來(lái)自丙二酰輔酶A的3個(gè)乙酰集團(tuán)通過(guò)連續(xù)的縮合反應(yīng)連接到特異起始底物 N-甲基鄰氨基苯 (甲) 酰輔酶 A(n-Methylanthraniloyl-CoA) 分子上，之后通過(guò)克萊森 (Claisen) 型環(huán)化反應(yīng)生成吖啶酮化合物——1,3二甲基-N-甲基吖啶酮 (1,3-dihydroxy-N-methylacridone) (表1、圖2)[30]。蕓香科植物不論是CHS還是STS在體外條件下都不能利用N-甲基鄰氨基苯 (甲) 酰輔酶A作為起始底物，而野生型的ACS卻可以利用4-香豆酰輔酶A合成柚皮素查爾酮，其活性是以N-甲基鄰氨基苯 (甲) 酰輔酶A為起始底物的15%[31]。像其他類型III PKS一樣，ACS氨基酸序列中有近 100處與 CHS有所差異，其中 ACS三聯(lián)體突變體 (T132S/S133A/F265V) 能夠明顯降低ACS利用N-甲基鄰氨基苯(甲)酰輔酶A為起始底物的能力，卻能夠顯著增加對(duì)4-香豆酰輔酶A的親和性[32]，這3個(gè)氨基酸對(duì)于ACS相對(duì)于CHS的活性變化非常重要，然而，ACS三聯(lián)體突變體 (T132S/S133A/F265V) 仍然能保持一定吖啶酮合成能力的事實(shí)說(shuō)明，仍然有其他一些重要的位點(diǎn)對(duì)于ACS功能有作用[32]。目前已知的近百種吖啶酮生物堿大部分特異地分布在蕓香科植物家族中，近期也有報(bào)道在胡椒科 (Piperaceae) 植物中發(fā)現(xiàn)了這類化合物[30]。該類化合物屬于生物堿植物抗毒素，同時(shí)具有許多誘人的生物學(xué)活性，但由于其干擾DNA合成，其在醫(yī)學(xué)治療方面的作用受到限制[33]。

3.7 二苯甲酮合酶 (BPS) 和聯(lián)苯合酶 (BIS)

我們對(duì)二苯甲酮合酶 (Benzophenone synthase，BPS)[34]和聯(lián)苯合酶 (Biphenyl synthase，BIS)[35]酶學(xué)性質(zhì)及功能研究結(jié)果表明，BPS和BIS之間的功能關(guān)聯(lián)與CHS和STS之間的關(guān)系完全相同，只是起始底物有所差別。CHS和STS使用4-香豆酰輔酶A，而B(niǎo)PS和BIS使用苯甲酰輔酶A (Benzoyl-CoA) 為起始底物。BPS催化來(lái)自丙二酰輔酶A的3個(gè)乙酰集團(tuán)通過(guò)連續(xù)的縮合反應(yīng)連接到苯甲酰輔酶A分子上，之后通過(guò)克萊森型環(huán)化反應(yīng)機(jī)制生成Phlorbenzophenone。而B(niǎo)IS則能夠利用與BPS相同的底物催化合成相同的中間體產(chǎn)物，后續(xù)環(huán)化反應(yīng)中，BIS運(yùn)用分子內(nèi)醛醇縮合 (Aldol condensation) 反應(yīng)機(jī)制生成3,5-二羥基聯(lián)苯 (3,5-Dihydroxybiphenyl)，且伴有C1位置脫羧反應(yīng) (表1、圖2)。BPS是合成苯甲酮 (Benzophenones) 和 (夾) 氧二苯甲酮(Xanthones) C13基本骨架的關(guān)鍵酶，苯甲酮衍生物為天然酚類化合物，具有誘人的藥理學(xué)特性，如Guttiferone F具有很強(qiáng)的抗HIV和抗微生物活性[36]。BIS是合成聯(lián)苯化合物 (Biphenyls) 的起始酶[35]。聯(lián)苯化合物是薔薇科 (Rosaceae) 蘋果亞科(Maloideae) 中一類植物抗毒素，且具有明顯的種屬特性[37]。該類植物包括了溫帶常見(jiàn)的觀賞和食用植物，如蘋果、梨及花楸、山楂等。

3.8 2-吡喃酮合酶 (2-PS)

2-吡喃酮合酶 (2-PS) 克隆于觀賞雛菊Gerbera hybrida。與 CHS不同，2-PS不能利用 4-香豆酰輔酶A，而是利用乙酰輔酶A (Acetyl-CoA) 作為起始底物，其催化來(lái)自丙二酰輔酶A的2個(gè)乙酰集團(tuán)通過(guò)連續(xù)的縮合反應(yīng)連接到乙酰輔酶A分子上，之后通過(guò)內(nèi)酯化 (Lactone) 反應(yīng)生成6-甲基-4羥基-2-吡喃酮 (6-methyl-4-hydroxy-2-pyrone) (表 1、圖 2)[37]。在不含乙酰輔酶A的體外酶促體系中，2-PS也可以利用丙二酰輔酶A脫羧后的乙酰輔酶A作為起始底物，只是催化效率下降10倍。以g2ps1為探針，一系列相似酶從觀賞雛菊和其他 4個(gè)菊科植物中被克隆。與CHS序列比對(duì)結(jié)果表明，在被子植物菊科家族產(chǎn)生進(jìn)化分化之前，2-PS亞家族極有可能通過(guò)一個(gè)單基因重復(fù)事件從一個(gè)CHS進(jìn)化而來(lái)[38]。基于紫花苜蓿M. sativaCHS晶體結(jié)構(gòu)同源模擬結(jié)果顯示，與 CHS相比，2-PS的催化腔體積較小[39]。定點(diǎn)突變研究結(jié)果表明，CHS三聯(lián)體突變體(T197L/G256L/S338I) 的功能與2-PS完全相同[40]。2-PS為2種含有還原型甲基吡喃酮基本骨架的化合物 (Gerberin和parasorboside) 提供了前體，這兩種化合物的糖甙及其衍生物存在于多種植物中，具有很好的抑制細(xì)菌、真菌和預(yù)防昆蟲(chóng)攝食的作用[37]。體外酶促反應(yīng)中，2-PS可以利用苯甲酰輔酶 A(Benzoyl-CoA) 為起始底物產(chǎn)生 6-苯基-4-羥基-2-吡喃酮 (6-phenyl-4-hydroxy-2-pyrone)，該化合物結(jié)構(gòu)符合 HIV-1蛋白酶抑制劑家族基本特征，可能具有潛在的功能[37]。

3.9 蘆薈松合酶 (ALS)

掌葉大黃R. palmatum蘆薈松合酶 (Aloesone synthase，ALS) 同樣以乙酰輔酶A為起始底物，以丙二酰輔酶A為延伸底物，值得關(guān)注的是，ALS催化2個(gè)底物間6步連續(xù)的縮合反應(yīng)，中間產(chǎn)物經(jīng)環(huán)化產(chǎn)生芳香族庚烯酮——蘆薈松 (Aloesone) (表1、圖2)[15]。ALS與CHS保持有60%的氨基酸序列同一性，并且保有幾乎所有的輔酶A結(jié)合位點(diǎn)，但在ALS中，CHS活性位點(diǎn)Thr197、Ile254、Gly256和Ser338分別被Ala、Met、Leu和Thr所取代，有意思的是這些氨基酸殘基在2-PS中同樣被取代[41]?；谧匣ㄜ俎. sativaCHS晶體結(jié)構(gòu)同源模擬結(jié)果顯示，ALS具有與CHS相同的三維結(jié)構(gòu)，但ALS催化腔體積 (1173 ?3) 要明顯大于CHS (1019 ?3) 和2-PS (298 ?3)，此結(jié)果暗示著活性中心三維空間體積有可能決定著聚酮化合物鏈延伸的長(zhǎng)度。ALS在大黃 (Rhubarb) 中的產(chǎn)物，如 AloesoneO-glucoside(7-O-β-D-glucopyranoside) 和 AloesoneC-glucoside(8-C-β-D-glucopyranoside) 具有很強(qiáng)的消炎活性[15]。

圖2 植物類型III PKSs超家族成員催化反應(yīng)過(guò)程及產(chǎn)物 (環(huán)化反應(yīng)類型及位置在圖中標(biāo)出，反應(yīng)機(jī)制見(jiàn)表1參考文獻(xiàn))Fig.2 Comparison of the reactions and products of known divergent plant type III PKSs. The position and type of cyclization reaction (Claisen, aldol, or lactone) of each presumed linear polyketide intermediate is depicted. The reaction mechanism of plant-specific type III PKSs was as described in the references of Table 1.

3.10 苯戊酮合酶 (VPS)

啤酒花 (Humulus lupulus，hops) 苯戊酮合酶(Valerophenone synthase，VPS) 以脂肪酰輔酶A——異戊酰基或異丁?；o酶 A (Isovaleryl-或 Isobutyryl-CoA) 為起始底物，以丙二酰輔酶 A為延伸底物，催化2個(gè)底物間3步連續(xù)的縮合反應(yīng)，中間產(chǎn)物經(jīng)克萊森型環(huán)化反應(yīng)生成 Phlorisovalerophenone或Phlorisobutyrophenone。有趣的是，在體外酶促反應(yīng)中，CHS可以接受異戊?；?CoA為起始底物，其產(chǎn)物為 Phlorisovalerophenone和一個(gè)丙烯酮內(nèi)酯副產(chǎn)物的混合物，而VPS卻不能利用CHS香豆酰輔酶A作為起始底物[42]。VPS與CHS氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，二者在鄰近CHS“起始底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域”周圍存在許多有意思的差異，CHS中保守的 Thr132和Thr197，在啤酒花VPS中分別被Gly和Ile取代。第 2個(gè) VPS發(fā)現(xiàn)于原始維管植物松葉蕨Psilotum nudum中，其在132和197位置上都為Ser，且CHS和啤酒花VPS中保守的Ser338在松葉蕨VPS中被Val取代[2]。VPS在啤酒花中的代謝產(chǎn)物，一系列苦味酸物質(zhì)，如蛇麻烯 (Humulone) 和蛇麻酮(Lupulone) 賦予啤酒獨(dú)特的口味[2]。

3.11 戊烯酮-色酮合酶 (PCS) 和辛烯酮合酶(OKS)

戊烯酮-色酮合酶 (Pentaketide chromone synthase，PCS) 能夠催化丙二酰輔酶 A分子間連續(xù) 4步的縮合反應(yīng)產(chǎn)生 5,7-dihydroxy-2-methylchromone[43]，而辛烯酮合酶 (Octaketides synthase，OKS) 則可以催化丙二酰輔酶A分子間連續(xù)7步的縮合反應(yīng)產(chǎn)生芳香族辛烯酮產(chǎn)物——Octaketides SEK4和SEK4b[44]。序列比對(duì)結(jié)果顯示，OKS與植物類型III PKS超家族其他成員酶保持有50%～60%的氨基酸序列同一性，與 ALS、PCS及 2-PS相同，CHS活性位點(diǎn)Thr197、Gly256和 Ser338分別被其他氨基酸所取代。同源模擬結(jié)果顯示，OKS的催化腔體積為(1124 ?3)，適合其完成連續(xù)7步的縮合反應(yīng)。日本蘆薈Aloe arborescensPCS為平喘藥 Kehellin和Visnagin生物合成提供了前體化合物[43]；而來(lái)自相同植物的OKS可能為抗生素類藥物辛烯酮提供了前體化合物[44]。

4 總結(jié)和展望

植物類型 III PKS超家族成員功能多樣性和底物特異性的冗雜是這個(gè)研究領(lǐng)域內(nèi)公認(rèn)的。超家族內(nèi)其他成員酶 (CHS-Like) 功能的多樣性均來(lái)自其原型酶——CHS活性位點(diǎn)的小的修飾，這些小的變動(dòng)影響了該類酶活性中心空間構(gòu)象，這種空間變化極大改變了酶分子的起始底物選擇性、鏈延伸長(zhǎng)度和環(huán)化反應(yīng)機(jī)制。因此，揭示植物類型III PKS超家族結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)聯(lián)，對(duì)于利用該類酶進(jìn)行基因工程、代謝工程遺傳操作是不可或缺的。

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Plant-specific type III polyketide synthase superfamily:gene structure, function and metabolistes

Lanqing Ma1, Guanglu Shi1, Hechun Ye2, Benye Liu2, and Younian Wang1

1Key Laboratory of Urban Agriculture(North)of Ministry of Agriculture China,Beijing University of Agriculture,Beijing102206,China
2Key Laboratory of Phytosynthesis and Environmental Molecular Physiology,Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Beijing100093,China

Received:January 19, 2010;Accepted:June 18, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 30170759, 30571506), Beijing Municipal Natural Science Foundation (No. 6071001),Funding Project for Academic Human Resources Development in Institutions of Higher Learning under the Jurisdiction of Beijing Municipality (Nos.PXM2007-014207-044536, PXM2007-014207-044538).

Corresponding author:Benye Liu. Tel: +86-10-62836244; Fax: +86-10-62836249; E-mail: benyel@ibcas.ac.cn

Younian Wang. Tel/Fax: +86-10-80799006; E-mail: lqma@bac.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (Nos. 30170759, 30571506)，北京市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. 6071001)，北京市屬高校人才強(qiáng)教計(jì)劃 (Nos.PXM2007-014207-044536, PXM2007-014207-044538) 資助。