謝池楚，陳月華,2，蔡峻,2，劉傳，陳艷玲

1 南開大學微生物學系，天津 300071

2 分子微生物學與技術教育部重點實驗室，天津 300071

工業(yè)生物技術

Bt幾丁質酶的基礎表達及誘導合成的多態(tài)現(xiàn)象

謝池楚1，陳月華1,2，蔡峻1,2，劉傳1，陳艷玲1

1 南開大學微生物學系，天津 300071

2 分子微生物學與技術教育部重點實驗室，天津 300071

多數(shù)微生物可以產(chǎn)生幾丁質酶。一般認為幾丁質酶基因表達受幾丁質的誘導和葡萄糖抑制。但是蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis(簡稱Bt) 幾丁質酶的誘導表達方式是否與其他微生物相同，至今尚無定論。采用DNS法檢測77株Bt在有或無誘導物培養(yǎng)基中的幾丁質酶活力。研究了葡萄糖對4株不同表達類型菌株酶活力的影響，以及葡萄糖抑制與幾丁質誘導之間的關系。研究發(fā)現(xiàn)在無幾丁質誘導條件下，全部試驗菌株都可以產(chǎn)生幾丁質酶，保持一定量的基礎表達，說明Bt能組成型合成幾丁質酶，不需要誘導。添加誘導物之后，31株菌的酶活力沒有任何變化，44株菌有不同程度的提高，但其中絕大部分誘導特性并不典型，酶活力提高不顯著。許多Bt菌株幾丁質酶表達兼具組成型和誘導型的特點。葡萄糖能夠抑制幾丁質的誘導作用，但是不能完全抑制Bt菌株幾丁質酶的基礎表達。比較組成型和誘導型菌株的幾丁質酶基因chiA、chiB調節(jié)區(qū)域核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)僅存在個別堿基的差異。

蘇云金芽胞桿菌，幾丁質酶，基礎表達，誘導多態(tài)性

Abstract:Chitinases were produced by a lot of microorganisms. Chitinase gene expression in most of the chitinase producing bacteria was inducible by chitin. Low levels of chitinase were observed in the presence of glucose. To date, however, the regulation of such chitinase gene inBacillus thuringiensishad not been well studied. In this paper, all 77Bacillus thuringiensisstrains were grown in the medium with or without chitin. We measured quantitatively the chitinase activity of the cultures. Moreover, we investigated the suppressive effect of glucose on chitinase of 4strains. Also we studied the relationship between chitin induction and glucose suppression on chitinase. This investigation demonstrated that alltestedB. thuringiensisstrainscould produce chitinase without chitin. After induction, the chitinolytic activity of 31 tested strains had no obvious response to the inducer, whereas 44 stains increased in different degree. Among these strains, most of them did not markedly increase the levels of chitinase, and many stains simultaneously displayed the expression mode of inducible and constitutive. The glucose inhibited the inductive effect of chitin, but it could not inhibit the basal expression of chitinase. Two strains No. 38 and No. 75 belonged to different expression types. But we just found several different bases in the regulatory region of chitinase geneschiAandchiBfrom them.

Keywords:Bacillus thuringiensis, chitinase, essential expression, inducible synthesis polymorphism

幾丁質酶 (Chitinase，EC3.2.1.14) 是一種專一性降解幾丁質的水解酶類，可將幾丁質降解為幾丁單糖或寡糖[1]?；趲锥≠|酶在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、臨床醫(yī)學和制藥等方面的重要作用，近年來引起人們廣泛的關注[2]。蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis(簡稱Bt) 是商業(yè)化的殺蟲細菌，在我國已開發(fā)應用幾十年。Bt除了能夠形成殺蟲晶體外，也普遍產(chǎn)生幾丁質酶[3-4]。不少學者已經(jīng)克隆并表達 Bt幾丁質酶基因，證明該酶不但可以抑制真菌的生長還能夠明顯增效Bt的殺蟲活性[4-7]。然而，一般認為Bt幾丁質酶也是誘導酶，在不加誘導物時，酶活力很低或幾乎沒有。因此 Thamthiankul等和 Hu等把幾丁質酶結構基因同其它基因的啟動子融合，成功地使幾丁質酶不需誘導而組成型表達，使Bt的殺蟲活性顯著提高[8-9]。

幾丁質酶普遍存在于各種微生物中。一般認為微生物幾丁質酶基因受抑制物/誘導物系統(tǒng)的調控，葡萄糖明顯抑制幾丁質酶的合成[10]。目前報道的各類產(chǎn)生幾丁質酶的微生物菌株都是在幾丁質平板上篩選出來的，這些菌株在無誘導物存在時是否能夠產(chǎn)生幾丁質酶，至今國內外未見報道。因此，不少學者在研究各類微生物的幾丁質酶時，為了獲得更高的酶活力都會自然地在培養(yǎng)基中加入幾丁質或其衍生物作為誘導物[11-13]。

最近Arora、Barboza以及本實驗室分別發(fā)現(xiàn)某些 Bt菌株能在沒有誘導物的培養(yǎng)基中產(chǎn)生幾丁質酶，并且加入葡萄糖對酶的表達影響不大[14-16]。這些組成型表達幾丁質酶的Bt菌株僅是個別現(xiàn)象還是普遍存在？目前尚無定論。關于Bt菌株自身幾丁質酶表達的調控研究，幾乎未見任何報道。而了解Bt幾丁質酶的表達特點才可以有效地利用及改造這一功能基因，也能為提高Bt應用范圍和增強其生防效率提供依據(jù)。同時為微生物碳源利用與基因調節(jié)方面的重大理論問題提供相關研究基礎。

本研究利用遺傳學方法將含有幾丁質酶基因的77株 Bt菌株[4]培養(yǎng)在有/無誘導物的培養(yǎng)基中，比較各個菌株對誘導物的應答特點及其酶活力。經(jīng)統(tǒng)計分析后我們發(fā)現(xiàn)，多數(shù)蘇云金芽胞桿菌能夠組成型表達幾丁質酶，又兼具誘導特性，表現(xiàn)出酶合成的多態(tài)現(xiàn)象。本文首次就以上研究結果進行報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株、培養(yǎng)基

蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis共77株，全部含有幾丁質酶編碼基因，由本實驗室保藏。其中 17株保藏于南開大學微生物資源保藏中心(NKCCMR)，2株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)。對照菌株地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformisMY75，本室鑒定并保藏[17]。質粒轉化宿主為大腸桿菌Escherichia coliXL-Blue。培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基用于活化Bt菌；基礎培養(yǎng)基 (M)：每 100 mL水中含 KH2PO40.1 g，Na3PO40.2 g，MgSO40.05 g，KCl 0.05 g，酵母粉 1 g，pH 7.2～7.4；幾丁質誘導培養(yǎng)基 (C)：在M中加入1%幾丁質粉；葡萄糖培養(yǎng)基 (G)：在M中加入2.5%葡萄糖；幾丁質、葡萄糖培養(yǎng)基 (GC)：在 M 中加入等量的葡萄糖和幾丁質粉。膠體幾丁質的制備參照文獻[18]進行。

1.1.2主要試劑和儀器

幾丁質購買自浙江省玉環(huán)縣海洋生物化學有限公司。PCR擴增試劑和克隆用pMDTM18-T載體，購自大連寶生物公司；DNA回收純化試劑盒、及質粒分離純化試劑盒等購自上海Sangon公司。主要儀器有：BioRad Smartspect 3000紫外分光光度計和MJ Research PCR儀。

1.2 幾丁質酶活力的測定

77株菌在LB培養(yǎng)基中活化12 h后按1%量分別轉接培養(yǎng)基M和C，30℃振蕩培養(yǎng)72 h檢測酶活力。酶活力的測定采用 3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，簡稱DNS) 比色法[19]。一個酶活力單位定義為：50℃、pH 6.0條件下反應1 min產(chǎn)生1 μg N-乙酰氨基葡萄糖 (NAG) 的酶量。酶活力測定結果均為3次以上試驗的平均值。通過生物統(tǒng)計軟件SPSS 16.0中的t檢測法分析實驗結果。

1.3 葡萄糖對幾丁質酶活力影響的測定

將實驗的Bt菌株在LB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)12 h后，按 1%量轉接培養(yǎng)基 G、C和 GC。30℃搖床振蕩培養(yǎng) 3 d后，含葡萄糖培養(yǎng)物的上清液使用MILLIPORE離心超濾管濃縮后，磷酸緩沖液 (pH 6.0)洗1次，除去殘余葡萄糖，加入磷酸緩沖液至原體積，再進行酶活力測定，并使用DNS法測定上清液中剩余含糖量。

1.4 幾丁質酶基因chiA、chiB的克隆

常規(guī)方法提取菌株的基因組DNA作為PCR模板。chiA和chiB基因擴增均采用touchdown PCR程序。擴增chiA所用引物：chiAF：5′-ATCATTGTAATG TGGCGTAT-3′，chiAR：5′-TAAATCGTGGTATTGGG AC-3′；PCR 擴增條件：94 ℃ 4 min；94℃50s，51℃～48℃復性50s，每個循環(huán)降低1℃，72 ℃ 1.5 min ，小循環(huán)4次共計30個循環(huán)；72 ℃ 10 min 。擴增chiB所用引物及條件參照文獻[16]。將電泳檢測正確的擴增片段回收純化后連接pMDTM18-T克隆載體，轉化E.coliXL-Blue感受態(tài)細胞。提取轉化子的重組質粒，鑒定后送公司測序。核苷酸序列分析使用BLAST、BDGP和SoftBerry-Bprom在線分析軟件。

2 結果與分析

2.1 77株蘇云金芽胞桿菌在有/無誘導物培養(yǎng)時幾丁質酶活力調查

在基礎培養(yǎng)基 (M) 和幾丁質誘導培養(yǎng)基 (C)中分別培養(yǎng)77株蘇云金芽胞桿菌，檢測每一菌株在2種培養(yǎng)基中的酶活力。經(jīng)過對數(shù)據(jù)的歸納分析后，按誘導效率由大至小排序，選取有代表性的 32株菌原始數(shù)據(jù)列于表1中。有關77株蘇云金芽胞桿菌酶活力分布統(tǒng)計和誘導效率將在2.2和2.3中分析。

從表1中基礎培養(yǎng)基 (M) 一欄的數(shù)據(jù)可見，在不誘導時32株菌都可以檢測到酶活力。表1中的前20個菌株經(jīng)誘導后的酶活力明顯比不誘導時高，其中多數(shù)菌株在 2種培養(yǎng)基中的酶活力差異極其顯著(P＜0.01)，誘導后的酶活力提高了30%以上，從這一特點考慮應稱這些菌株為誘導型。然而其中有些菌株如19、21、88號等6株菌 (陰影標記) 雖然誘導效果極其顯著，但是不誘導時它們的酶活力也比較高，可達到3 U/mL以上，兼具組成型特性。因此，這些菌株很難定義是組成型還是誘導型。

表1中后 12個菌株在有/無誘導物的 2種培養(yǎng)條件下的酶活力無太大的變化，統(tǒng)計分析結果大多無顯著性差異。這些菌株對幾丁質的誘導不表現(xiàn)應答能力，故稱為組成型菌株。少數(shù)菌株經(jīng)誘導后的酶活力反而更低，表現(xiàn)出負誘導效應。同屬組成型菌株，最低的23號菌株其酶活力不到0.5 U/mL，而54、27、36號等4株菌 (下劃線標記) 高達5 U/mL左右，是前一菌株的10倍，說明Bt菌株中基礎表達的幾丁質酶活力相差很大。

2.2 誘導前后77株菌幾丁質酶活力的分布統(tǒng)計

圖1是依據(jù)77株菌的酶活力結果，統(tǒng)計出誘導前后不同酶活力菌株數(shù)的分布。將酶活力低于1.5 U/mL的菌株稱為低酶活力菌株，酶活力在1.5～4.5 U/mL的為中等酶活力菌株，高于4.5 U/mL屬于高酶活力菌株。從圖中可以看出，無論誘導還是不誘導，低酶活力和中等酶活力Bt菌株都占絕大多數(shù)，高酶活力菌株很少。32株菌屬于低酶活力，約占42%。而中等酶活力以上的占58%共45株，其中高酶活力的僅有 5株。這一結果說明在無誘導條件下，實驗的菌株都能產(chǎn)生幾丁質酶 (具體數(shù)據(jù)見表1第2欄)，證明Bt能組成型基礎合成幾丁質酶，不需要誘導，只是酶活力普遍不高。而在加入誘導物之后，低酶活力的菌株減少一半，中等酶活力菌數(shù)則有一定幅度的提高，由40株上升至50株，占全部菌株的65%；高酶活力菌株略有增加。結果說明，雖然Bt合成幾丁質酶的能力不需要誘導，但仍有56%菌株對幾丁質誘導有反應，表現(xiàn)出經(jīng)誘導后酶活力提高的代謝規(guī)律。

圖1 在有無誘導培養(yǎng)條件下77株菌酶活力分布的統(tǒng)計Fig.1 Statistics of chitinase activity of 77 strains cultured with or without inducer.

表1 32株蘇云金芽胞桿菌在有/無誘導條件下的幾丁質酶活力Table 1 The chitinase activity of 32B.thuringiensisstrains (U/mL)

2.3 幾丁質誘導效率的統(tǒng)計分析

實驗對照菌株地衣芽胞桿菌MY75是典型誘導菌株，不誘導時酶活力僅為3.0 U/mL左右，誘導后可達45 U/mL以上，酶活力可以提高14.5倍！而同屬誘導型的Bt菌株，誘導效率遠遠不及MY75，且相差很大，絕大部分菌株誘導倍數(shù)在0.3～2.9之間?？梢婋m然都是芽胞桿菌，它們在碳源利用的代謝調控方式上存在著明顯差異。依據(jù)表1第4欄的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計出各種誘導效率菌株所占比例，見圖2。

圖2 77株菌中不同誘導效率菌株所占比例Fig.2 Ratios of different induction efficiency of the 77 strains.

從統(tǒng)計結果明顯看出，無誘導作用菌株和低誘導效率菌株占全部菌株的73%。證明大部分Bt菌株即使誘導，效果也非常不明顯，不能顯著提高酶活力。誘導后的酶活力比不誘導提高 1倍以上的約占全部菌數(shù)的18%，誘導效率高于2倍的僅占6%，還有3%菌株誘導后酶活力顯著降低。

2.4 葡萄糖對Bt幾丁質酶表達的影響

為了考察葡萄糖抑制效應對幾丁質酶表達的影響，用明顯誘導型菌株 33號、75號和組成型菌株38號、54號為材料，將地衣芽胞桿菌MY75菌株作為典型誘導型的對照，分別測定這些菌株在添加葡萄糖 (G)、添加幾丁質 (C) 和2種都添加 (GC) 的3種培養(yǎng)基中的酶活力。為了避免葡萄糖耗盡導致幾丁質酶的表達，對培養(yǎng)物上清中的殘?zhí)橇窟M行了測定，所有菌株的剩余葡萄糖量都為初始糖濃度的20%左右。考慮到在含有葡萄糖培養(yǎng)基中的生物量高于不含糖的培養(yǎng)基，為了消除誤差采用酶的比活力單位，即用幾丁質酶活力除以蛋白質的量 (mg)得出酶的比活力。詳細結果如圖3所示。

圖3 蘇云金芽胞桿菌4菌株在3種不同培養(yǎng)基中幾丁質酶的比活力Fig.3 Specific activity of four strains in three different culture medium. Values followed by different capital letters and small letters are significantly different at 0.01 and 0.05 levels respectively according tot-test.

圖中G和GC組數(shù)據(jù)反應出當培養(yǎng)基中存在葡萄糖時，葡萄糖阻遏作用及菌株對誘導物的應答情況。對照MY75菌株，G中酶比活力很低，證明葡萄糖嚴格地抑制酶的合成，而 GC中酶比活力明顯提高，兩組數(shù)據(jù)之間具有極顯著差異，誘導效率非常明顯。

在培養(yǎng)基中加入葡萄糖后，從圖中G組數(shù)據(jù)可以看出，實驗的4株Bt，無論組成型還是誘導型，酶的比活力都比對照菌株明顯高，證明蘇云金芽胞桿菌在無誘導物時仍有基礎表達，與上述77株菌在基礎培養(yǎng)基的檢測結論一致。該結果還證明這種基礎表達不能完全被葡萄糖抑制。

一般認為，酶在組成型表達的同時也表現(xiàn)出抗葡萄糖的阻遏作用。實驗的 4株菌中，38號和 54號是組成型，但只有54號在誘導物和葡萄糖同時存在的 GC培養(yǎng)基中，對誘導物仍有應答，表現(xiàn)明顯抗葡萄糖阻遏，C和 GC組數(shù)據(jù)無顯著性差異。38號不具備這一特征。而誘導型的33號也表現(xiàn)出抗葡萄糖阻遏的特征。說明葡萄糖在調節(jié)蘇云金芽胞桿菌幾丁質酶表達的方式上較為復雜。這些結果也進一步說明，依據(jù)酶的表達方式很難界定Bt菌株是組成型還是誘導型。

2.5 不同類型菌株幾丁質酶基因調節(jié)區(qū)域序列的差異分析

對誘導型菌株75號和組成型菌株38號，分別克隆了它們的幾丁質酶基因chiA、chiB。它們各自在GenBank的收錄編號見圖示。2個基因各自調節(jié)區(qū)域的全長，分別為起始密碼子上游194和226個堿基，包括了全部的順式作用元件，如 SD序列、?10、?35區(qū)以及完整的潛在啟動子。序列比對結果見圖4。

圖4上部分顯示2個菌株chiA基因調節(jié)區(qū)域。2條序列同源性達 93%，它們的調節(jié)元件如SD序列、?10區(qū)和?35區(qū)的堿基序列完全一致。僅有 6個堿基的差異，不同的堿基用暗色底紋標記。其中1個位于推測的啟動子內?70處，組成型38號菌株為G，而誘導型75號菌株為A。另外5個不同堿基分散于?3至?136處。

圖4下部分為2個chiB基因，它們調節(jié)區(qū)域的同源性達99%，僅有3個堿基不同，其中一個位于推測的?10區(qū)內，38號菌株為G，而75號菌株為T。另外2個不同堿基分別在?176和?184處。全部位于推測的啟動子內。

圖4 誘導型和組成型菌株chiA、chiB基因調節(jié)區(qū)域序列比對分析Fig.4 Sequence alignment of the regulatory region ofchiAandchiBfrom the constitutive and inducible strain. The different bases are in the gray background. The dot represents the same base. The start codon was named +1. The underlined sequences are the potential promoters. The bolded base is the putative start site of transcription. The framed sequences are the ?10 boxes and ?35 boxes.The italicized sequences are the putative Shine-Dalgarno sequences.

75號和 38號菌株分別為誘導型和組成型合成幾丁質酶菌株?；蛘{節(jié)區(qū)域的這些差異堿基有可能是酶合成調控中的關鍵作用位點，有待通過定點突變后的表型變化進一步證明。

3 討論

幾丁質酶廣泛存在于Bt中，但包括Bt在內的許多細菌幾丁質酶產(chǎn)生方式尚無定論。多數(shù)學者認為，細菌幾丁質酶的合成受到誘導物/抑制物系統(tǒng)的雙向調節(jié)，普遍以為經(jīng)幾丁質誘導后，酶的活力會大幅度提高[10]。本文首次較大范圍地調查了蘇云金芽胞桿菌幾丁質酶活力的分布及其誘導表達特性。研究證明絕大部分蘇云金芽胞桿菌幾丁質酶的合成不會因為存在誘導物而明顯提高，誘導效率高的僅為個別菌株，部分Bt菌株表達幾丁質酶兼具有組成型和誘導型特性。而幾丁質對不同菌株的誘導效率也存在差異，少部分菌株在誘導物存在的情況下酶活力反而降低。說明蘇云金芽胞桿菌在幾丁質酶合成的方式上具有多態(tài)性。不同菌株之間酶活力差異比較大，酶活力較高的菌株比較少，即使75號菌株誘導效率達到 10倍，但最終的酶活性也屬中等程度。因此，如果希望利用幾丁質酶加強Bt的殺蟲活性或者擴大其生防范圍，最好是引入高效表達的幾丁質酶基因[15]。

本實驗選取對誘導反應明顯和反應不明顯的 4株Bt菌，考察葡萄糖對幾丁質酶合成的阻遏作用。發(fā)現(xiàn)Bt菌株并不遵循組成型抗葡萄糖、誘導型對葡萄糖敏感的規(guī)律，同樣說明Bt菌株幾丁質酶合成存在多態(tài)現(xiàn)象。

在枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis及相近屬種中，涉及碳源分解代謝的控制屬于全局性調節(jié)，主要由調節(jié)蛋白復合物結合到靶操縱子的應答元件上而實施調控[20]。另有文獻報道，與蘇云金芽胞桿菌親緣關系極其接近的蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereuschiB基因中，具有調節(jié)蛋白可能結合的序列[21]。本研究中的38號和75號菌株的chiB基因調節(jié)區(qū)域中都含有這一順式作用元件，而chiA基因沒有類似序列。因此，Bt菌株兩種幾丁質酶基因的調節(jié)方式有可能不一樣，進一步使Bt菌株幾丁質酶的合成呈現(xiàn)多態(tài)性。

有學者在研究鏈霉菌的幾丁質酶基因表達時，將啟動子內同向重復序列中一個堿基改變，導致原本受幾丁質誘導、受葡萄糖阻遏的基因調控方式完全改變，轉錄時對葡萄糖不再敏感，能組成型表達幾丁質酶[11,22]。本研究發(fā)現(xiàn)，組成型與誘導型表達的chiB基因調節(jié)區(qū)域雖然僅有3個堿基不同，但全部位于推測的啟動子內。這些發(fā)現(xiàn)，為進一步從分子水平深入探討蘇云金芽胞桿菌chi基因中哪些序列或堿基是關鍵的調節(jié)部位奠定了研究基礎。

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Essential expression and inducible synthesis
polymorphism of chitinase inBacillus thuringiensis

Chichu Xie1, Yuehua Chen1,2, Jun Cai1,2, Chuan Liu1, and Yanling Chen1

1Department of Microbiology,Nankai University,Tianjin300071,China
2Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology,Ministry of Education,Tianjin300071,China

Received:April 27, 2010;Accepted:July 12, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30971957).

Corresponding author:Yuehua Chen. Tel: +86-22-23505964; Fax: +86-22-23508800; E-mail: yhchen@nankai.edu.cn

國家自然科學基金項目 (No. 30971957) 資助。