褚婷婷，謝華，徐勇，馬榮才

1 首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048

2 北京市農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

擬南芥FRUITFULL(FUL) 基因的表達(dá)調(diào)控模式

褚婷婷1,2，謝華1,2，徐勇2，馬榮才1,2

1 首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048

2 北京市農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097

FRUITFULL(FUL) 基因是一類(lèi)MADSbox基因，在控制開(kāi)花時(shí)間、花分生組織分化、莖生葉形態(tài)以及心皮和果實(shí)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。為了闡明FUL的表達(dá)調(diào)控模式，克隆了擬南芥Arabidopsis thalianaFUL啟動(dòng)子區(qū)(?2 148 bp～+96 bp) 及其第一內(nèi)含子，并構(gòu)建一系列啟動(dòng)子分段缺失表達(dá)載體及含F(xiàn)UL第一內(nèi)含子的融合載體。并進(jìn)一步構(gòu)建了各順式作用元件融合擬南芥TUBULIN和ACTIN啟動(dòng)子的表達(dá)載體。轉(zhuǎn)基因擬南芥分析結(jié)果表明，F(xiàn)UL啟動(dòng)子的上游存在2個(gè)抑制其表達(dá)的順式作用元件，其中一個(gè)很可能與轉(zhuǎn)錄因子AP1的結(jié)合有關(guān)；2個(gè)存在于上游調(diào)控區(qū)的CArG-box對(duì)FUL基因表達(dá)起到重要的調(diào)控作用；FUL基因第一內(nèi)含子參與擬南芥心皮和雄蕊的發(fā)育調(diào)控，而且有增強(qiáng)基因表達(dá)的作用。

擬南芥，F(xiàn)UL基因，啟動(dòng)子，第一內(nèi)含子，缺失分析，GUS活性

Abstract:FRUITFULL(FUL) is anMADSbox gene that functions early in controlling flowering time, meristem identity and cauline leaf morphology and later in carpel and fruit development inArabidopsis thaliana. In order to clarify the regulation ofFULexpression the upstream regulatory region, ?2 148 bp?+96 bp and the first intron of theFULgene were cloned, and vectors with a series of deletion ofFULpromoter, and the ones fused with the first intron were constructed. Vectors harboring the fusion ofcis-acting elements with the constitutive promoters ofTUBULINandACTINwere also constructed.β-Glucuronidase activity assays of the transgenic Arabidopsis plants showed that twocis-elements were involved in the repression ofFULexpression, with one of the two being probably the binding site of the transcriptional factor AP1. And the two CArG boxes played a important role inFULinitiation particularly. Furthermore, the first intronofFULwas shown toparticipate in the development of carpel and stamen as an enhancer.

Keywords:Arabidopsis thaliana,FULgene, upstream regulatory region, the first intron, deletion analysis, GUS activity

擬南芥Arabidopsis thaliana中FRUITFULL(FUL)基因，也稱(chēng)為AGL8(AGAMOUS-LIKE 8)[1]，屬于一類(lèi)MADSbox基因，編碼一種特異性轉(zhuǎn)錄因子。FUL和APETALA1(AP1)、CAULIFLOWER(CAL) 都屬于AP1/SQUA-like基因亞家族[2]，在花同源異型器官發(fā)育的ABCDE模型中，同屬A類(lèi)基因[3]。其中AP1是花序分生組織特征基因，也是花器官特征基因，促進(jìn)花瓣和萼片的發(fā)育[4]。而AP1的旁系同源基因CAL，只在花發(fā)育過(guò)程中促進(jìn)花分生組織的形成[5]。與AP1和CAL相比，F(xiàn)UL基因則具有更廣泛的功能：它既能在花發(fā)育早期促進(jìn)花序分生組織的形成，又能在花發(fā)育晚期心皮及幼嫩角果中表達(dá)，同時(shí)還能調(diào)控葉片的發(fā)育[6]。

在控制擬南芥開(kāi)花時(shí)間方面，F(xiàn)UL和TERMINAL FLOWER(TFL)[7]、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OFCONSTANS 1(SOC1)[8]等起到促進(jìn)花起始發(fā)育的作用。擬南芥是兼性長(zhǎng)日照植物，在長(zhǎng)日照 (16 h/d) 條件下比短日照 (8 h/d) 提前開(kāi)花。在光周期依賴(lài)性開(kāi)花途徑中，各種光周期調(diào)節(jié)基因由整合子CONSTANS(CO) 整合后，激活FLOWER LOCUS T(FT) 基因在葉片維管束中表達(dá)，F(xiàn)T被運(yùn)送到頂端分生組織后，引發(fā)FUL和SOC1在頂端分生組織中表達(dá)，F(xiàn)UL參與調(diào)控芽分生組織向花序分生組織的轉(zhuǎn)變，隨后FUL和SOC1在發(fā)育的花序原形成層中表達(dá)誘導(dǎo)其向花分生組織的轉(zhuǎn)變，從而控制開(kāi)花時(shí)間[9]。

在擬南芥發(fā)育早期，F(xiàn)UL受AP1負(fù)調(diào)控。早期的營(yíng)養(yǎng)器官內(nèi)FUL幾乎不表達(dá)，直至擬南芥轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)后，F(xiàn)UL基因才在花序分生組織中強(qiáng)烈表達(dá)[1]。FUL由于受到AP1抑制，最初只限定在花序分生組織中間的肋狀區(qū) (Rib zone) 中表達(dá)。植株抽薹后，主莖花序延伸明顯，莖生葉發(fā)育成披針形，葉腋處產(chǎn)生無(wú)限花序分生組織，后來(lái)，產(chǎn)生側(cè)生有限花序分生組織，后者只分化為不含托葉的花。在花發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)UL在花分生組織的中央?yún)^(qū)域表達(dá)，此區(qū)域后期發(fā)育成心皮。在心皮發(fā)育初期，F(xiàn)UL在整個(gè)心皮原基中表達(dá)，而隨著心皮的繼續(xù)發(fā)育，F(xiàn)UL則主要集中在心皮的外壁上表達(dá)，并從其他類(lèi)型的心皮組織細(xì)胞如胚珠、花柱、柱頭以及子房隔膜上消失[10]。此外，當(dāng)擬南芥轉(zhuǎn)為生殖生長(zhǎng)后可檢測(cè)到FUL在芽分生組織、蓮座葉、莖生葉中也有表達(dá)。Bamnolker等發(fā)現(xiàn)，在葉片中，F(xiàn)T的產(chǎn)物促進(jìn)FUL和SEPALLATA3(SEP3) 在蓮座葉、莖生葉的維管束中表達(dá)，從而控制葉片的形態(tài)[11]。

FUL基因控制擬南芥果實(shí)發(fā)育的功能也備受關(guān)注。一方面，F(xiàn)UL控制角果的伸長(zhǎng)，突變體ful植株的心皮在受精后不久就停止伸長(zhǎng)，導(dǎo)致生成短小的果莢。同時(shí)，F(xiàn)UL也控制角果果皮細(xì)胞的發(fā)育，ful突變體的果皮細(xì)胞發(fā)育受阻，形成拉鏈狀扭曲的果皮[12]。另外，F(xiàn)UL基因也與擬南芥角果果莢開(kāi)裂的性狀有關(guān)。研究表明果莢離層特異基因SHATTERPROOF1(SHP1)/SHATTERPROOF2(SHP2)[13]促進(jìn)下游基因ALCATRAZ(ALC) 和INDEHISCENT(IND) 的表達(dá)，其中基因IND控制果莢離層的7層細(xì)胞的不均等分裂[14]，而ALC控制果莢離層細(xì)胞的木質(zhì)化[15]。在果莢中FUL基因抑制SHP1/2基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制ALC和IND在果莢中的表達(dá)，阻止果莢的木質(zhì)化[16]。假隔膜中有REPLUMLESS(RPL) 基因[17]抑制SHP1/2、ALC和IND在假隔膜中的表達(dá)。因此，在FUL和RPL共同抑制作用下，SHP1/2、ALC和IND基因只在果莢離層里表達(dá)，從而調(diào)控了果莢的開(kāi)裂。研究表明，過(guò)表達(dá)FUL的轉(zhuǎn)基因擬南芥果莢離層細(xì)胞中SHP1/2、ALC和IND表達(dá)量下降，離層細(xì)胞形成受阻，且木質(zhì)化程度降低，導(dǎo)致成熟角果的果莢不開(kāi)裂[18]。蕓苔屬農(nóng)作物，如油菜，由于果莢開(kāi)裂造成產(chǎn)量降低，是導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失的重要方面，而易位表達(dá)FUL在控制果莢開(kāi)裂的特性中起到重要作用，因此具有一定的研究?jī)r(jià)值[19]。

對(duì)于FUL基因功能的研究已經(jīng)比較深入，然而對(duì)于FUL基因上游調(diào)控元件、內(nèi)含子作用及表達(dá)調(diào)控模式的研究還很不深入。因此本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步闡明FUL基因表達(dá)的時(shí)空特異性及調(diào)控模式，試圖找到起作用的順式作用元件，及其調(diào)控的分子基礎(chǔ)，以期進(jìn)一步揭示調(diào)控FUL基因表達(dá)的上游基因產(chǎn)物的作用位點(diǎn)，為后期深入研究FUL基因的新功能及其參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥Arabidopsis thalianaCol-0植株；菌種為大腸桿菌Escherichia coli菌株DH5α，根癌農(nóng)桿菌菌株Agrobacterium tumefaciensC58 (GV 3101::pMP90RK)；質(zhì)粒為pBI121。所用菌種、質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。限制性?xún)?nèi)切酶、Taq酶、Ex Taq酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自大連TaKaRa試劑公司。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 各種植物表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù) http://www.arabidopsis.org/搜索到基因FRUITFULL(At5G60910)、ACTIN(At3G46520)[20]和TUBULIN(At5G62690)[21]的序列，設(shè)計(jì)各種引物，見(jiàn)表1。通過(guò)PCR擴(kuò)增得到FUL的啟動(dòng)子序列 (簡(jiǎn)稱(chēng)為 PFUL) 及第一內(nèi)含子序列 (簡(jiǎn)稱(chēng)為 Intron1)，ACTIN啟動(dòng)子序列 (簡(jiǎn)稱(chēng)為PACT)，TUBULIN啟動(dòng)子序列(簡(jiǎn)稱(chēng)為PTUB)。并通過(guò) PLACE Web Signal Scan找到FUL啟動(dòng)子上游 DNA元件 CArG box(CC(A/T)6GG)[22]。CaMV 35S啟動(dòng)子中46 bp的基本啟動(dòng)子區(qū)mini35S序列[23]。

構(gòu)建一系列表達(dá)框：FUL啟動(dòng)子序列的分段缺失表達(dá)框 PFUL2244(?2 148 bp～+96 bp)；PFUL2083(?1 987 bp～+96 bp)；PFUL1580(?1 484 bp～+96 bp)；PFUL1124 (?1 028 bp～+96 bp)；PFUL474(?378 bp～+96 bp)；FUL第一內(nèi)含子融合CaMV35S基本啟動(dòng)子 mini35S的表達(dá)框 Intron1+mini35S；PFUL2244融合Intron1的表達(dá)框PFUL2244+Intron1；PFUL2244刪除含2個(gè)CArG-box的?1 916 bp～?1 737 bp區(qū)的表達(dá)框PFUL△CArG；TUBULIN、ACTIN啟動(dòng)子的表達(dá)框PTUB、PACT；FUL的上游調(diào)控序列PFUL161(?2 148 bp～?1 987 bp) 分別融合 PTUB、PACT的表達(dá)框PFUL161+TUB、PFUL161+ACT；PTUB、PACT分別融合 Intron1的表達(dá)框 PTUB+Intron1、PACT+Intron1。將上述所有表達(dá)框代替pBI121載體中的CaMV35S啟動(dòng)子，啟動(dòng)GUS表達(dá)，各表達(dá)框示意圖見(jiàn)圖1。

1.3 擬南芥轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性苗篩選

參考 Clough和 Bent的方法[24]。電擊法將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌 C58中，將含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接入YEP培養(yǎng)基中 (含Kan 100 mg/L；Ter 10 mg/L；Rif 50 mg/L)，200 r/min、28℃小搖過(guò)夜，再在400～500 mL YEP培養(yǎng)基中 (含Kan 100 mg/L；Ter 10 mg/L；Rif 50 mg/L) 接種 3 mL菌液，200 r/min、28℃大搖過(guò)夜至OD600大于 2.0。在4 900 ×g、4℃離心15 min收集菌體，并懸浮于大約3倍體積的滲透培養(yǎng)液，此時(shí)的OD600約為0.8。采用花序浸漬法完成對(duì)擬南芥的侵染，將植株移入正常條件下培養(yǎng)3～4周，收集種子。將收獲的擬南芥T0代種子經(jīng)消毒處理后，播種于含50 mg/L Kan的1/2 MS培養(yǎng)基平板上，4℃低溫處理2～3 d轉(zhuǎn)入20℃光照培養(yǎng)室。將初步得到的陽(yáng)性苗移到營(yíng)養(yǎng)土中，繼續(xù)培養(yǎng)。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的引物Table 1 Primers used in the experiment

圖1 構(gòu)建的表達(dá)框Fig.1 Construction of expression cassettes.represents the upstream regulatory sequences of FUL;represents GUS coding region;representsNos;represents CArG box;represents Intronl;represents 1PTUB;representsPACT;represents MINI35S Promoter;represents deletion of two GArG box.

1.4 GUS活性檢測(cè)

T0代植株收獲種子后，經(jīng)連續(xù)4代的卡那霉素抗性篩選、PCR檢測(cè)選擇，在T3代得到各轉(zhuǎn)基因植株的純合株系。GUS組織化學(xué)染色參考Jefferson的方法[25]。取每種轉(zhuǎn)基因材料 T3代經(jīng) PCR鑒定為陽(yáng)性的15～20個(gè)獨(dú)立株系，將植物組織浸入適量的染色緩沖液中，后加入適量的濃度為1 mg/mL X-Gluc溶液，抽真空 5 min，密封 37℃避光過(guò)夜，70%酒精漂洗多次脫除葉綠素，觀察組織是否有藍(lán)色出現(xiàn)。將各種轉(zhuǎn)基因植株染色后在Leica MZ16F熒光體式顯微鏡下觀察并拍照。

GUS定量分析參考 Gallagher的方法[26]。GUS活性用每毫克蛋白每分鐘形成的 4-MU的 pmol表示，取每種轉(zhuǎn)基因材料T3代15～20個(gè)獨(dú)立株系進(jìn)行測(cè)量求各自平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1FUL啟動(dòng)子分段缺失轉(zhuǎn)基因植株的 GUS活性

各種轉(zhuǎn)基因T3代植株經(jīng)PCR鑒定后，取PCR結(jié)果為陽(yáng)性的15～20個(gè)獨(dú)立株系進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。其中每種轉(zhuǎn)基因植株都有一定比例 (約65%～82%) 的獨(dú)立株系染色結(jié)果相同，具體比例數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

轉(zhuǎn)基因植株P(guān)FUL2244播種后7 d (圖2a)、14 d(圖2b)、21 d (圖2c) 的植株GUS染色均為陰性。抽苔開(kāi)花后，PFUL2244 (圖2d，2e) 在蓮座葉、莖生葉和花的萼片中有GUS表達(dá)，而野生型Col-0沒(méi)有GUS活性 (圖2f)。

轉(zhuǎn)基因植株P(guān)FUL2083播種后7 d (圖3a)、14 d(圖3b)、21 d (圖3c) 的植株幼苗期子葉和幼小蓮座葉均有GUS表達(dá)。抽苔開(kāi)花后，PFUL2083 (圖3d，3e) 在蓮座葉、莖、莖生葉及花的萼片均有GUS活性。并且PFUL2083的GUS活性比PFUL2244增加0.4 倍 (圖 6)。

表2 各轉(zhuǎn)基因植株相同表達(dá)模式株系所占比例Table 2 Proportion of same expression patterns in different transgenic plants

圖2 最長(zhǎng)啟動(dòng)子PFUL2244的GUS染色模式Fig.2 GUS staining of transgenic plant PFUL2244. (a, b, c)GUS staining of seedlings at 7, 14 and 21 days of the transgenic plant PFUL2244, respectively. (d) GUS staining of PFUL2244 after the transition from vegetative growth to reproductive growth. (e) GUS staining of floral organ of PFUL2244. (f) GUS staining of Col.

抽苔開(kāi)花后的轉(zhuǎn)基因植株 PFUL1580 (圖 3f)、PFUL1124 (圖3g) GUS染色均為陽(yáng)性，而PFUL474(圖 3h)、PFUL△CArG (圖 3i) 和野生型 Col (圖 2f)無(wú)GUS活性。并且PFUL1124 的GUS活性較強(qiáng)，PFUL1580較弱。

2.2FUL第一內(nèi)含子 (Intron1) 轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性

在營(yíng)養(yǎng)器官中，PFUL2244+Intron1和PFUL2244的GUS表達(dá)模式基本相同，而在生殖器官中，兩者產(chǎn)生明顯差別 (圖 4a，左 PFUL2244+Intron1，右PFUL2244)。PFUL2244+Intron1 (圖 4b) 從花蕾期到角果伸長(zhǎng)期在萼片和心皮中GUS都有表達(dá)，并且通過(guò)組織解剖染色可看到，隨著心皮的發(fā)育GUS活性從整個(gè)心皮向其兩端集中 (圖4c)。而且PFUL2244+Intron1在成熟雄蕊的花粉絲中也有明顯的GUS染色 (圖 4d，4e)。而 PFUL2244 只在萼片中表達(dá) GUS，心皮和雄蕊都沒(méi)有活性(圖 4f、4g、4h、4i)。這說(shuō)明FUL的第一內(nèi)含子在調(diào)控其表達(dá)模式中起著重要的作用。

圖3 各FUL啟動(dòng)子缺失片段轉(zhuǎn)基因植株GUS染色模式Fig.3 GUS staining of transgenic plants harboring different deletion ofFULpromoter. (a, b, c) GUS staining of seedlings at 7, 14 and 21 days of the transgenic plant PFUL2083,respectively. (d) GUS staining of PFUL2083 after the transition from vegetative growth to reproductive growth. (e) GUS staining of floral organ of PFUL2083. GUS staining of transgenic plants PFUL1580 (f), PFUL1124 (g), PFUL474 (h)and PFULCArG (i), respectively.

2.3 Intron1和PFUL161功能的進(jìn)一步研究

進(jìn)一步研究FUL第一內(nèi)含子 Intron1和上游?2 148 bp～?1 987 bp (PFUL161) 區(qū)的功能。轉(zhuǎn)基因植株 Intron1+mini35S (圖 5e) 在莖、葉片、萼片和柱頭中GUS表達(dá)均很強(qiáng)，比CaMV35S啟動(dòng)GUS(圖5a，為轉(zhuǎn) pBI121植株) 活性還強(qiáng)。ACTIN和TUBULIN啟動(dòng)GUS表達(dá)活性都比較弱，只在PTUB(圖5b) 葉脈、花芽中和PACT(圖5f) 葉片的葉脈、花托基部有少量表達(dá)。而 PTUB+Intron1 (圖 5c) 的GUS活性明顯提高，在葉片、花芽和莖中表達(dá)較強(qiáng)，PACT+Intron1 (圖5g) GUS活性也有提高，在花柄、萼片及莖中有較強(qiáng)表達(dá)。但 PFUL161+TUB(圖 5d)和 PFUL161+ACT(圖 5h) 的 GUS活性分別與PTUB、PACT沒(méi)有太大的差別。

圖4 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)FUL2244+Intron1和PFUL2244的GUS染色Fig.4 GUS staining of transgenic plants PFUL2244+ Intron1and PFUL2244. (a) GUS staining of PFUL2244+Intron1 (left) and PFUL2244 (right). (b, f) GUS staining of floral organs of PFUL2244+Intron1and PFUL2244 from bud to silique, respectively. (c, g)GUS staining of the carpels of PFUL2244+ Intron1 and PFUL2244 in different stages, respectively. (d, h) GUS staining of anatomical floral organ of PFUL2244+ Intron1and PFUL2244, respectively. (e, i) GUS staining of stamens of PFUL2244+Intron1and PFUL2244,respectively.

圖5 其他轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色Fig.5 GUS staining of other transgenic plants. GUS staining of transgenic plants pBI121 (a), PTUB(b), PTUB+Intron1 (c),PFUL161+TUB(d), Intron1+mini35S (e), PACT(f), PACT+Intron1 (g), PFUL161+ACT(h), respectively.

圖6 各轉(zhuǎn)基因植株GUS定量分析Fig.6 GUS activity analyses of different transgenic plants.

2.4 各種轉(zhuǎn)基因植株GUS活性定量分析

從每種轉(zhuǎn)基因株系T3代植株選取15～20株GUS組織化學(xué)檢測(cè)為陽(yáng)性的進(jìn)行GUS定量分析，各自取平均值代表各轉(zhuǎn)基因植株GUS表達(dá)的活性，見(jiàn)圖6。定量結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株 Intron1+mini35S GUS染色活性最高，約是轉(zhuǎn)基因植株pBI121的1.1倍。PFUL2244+Intron1、PFUL2083、PFUL1124 GUS 活性較強(qiáng)；PFUL2244、PFUL1580活性較弱；PFUL474和 PFUL△CArG幾乎無(wú) GUS活性；Intron1使TUBULIN和ACTIN驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)的能力增強(qiáng)；PFUL161抑制TUBULIN和ACTIN啟動(dòng)子的能力并不明顯，與GUS組織化學(xué)染色結(jié)果基本相符。

3 討論

基因的表達(dá)受到由 DNA上的順式作用元件與特異的反式作用因子構(gòu)成的調(diào)控復(fù)合物的調(diào)控，從而表現(xiàn)出時(shí)空特異性。轉(zhuǎn)錄因子與順式元件的相互作用可能誘導(dǎo)或抑制基因的表達(dá)，這些作用是通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的[27]。啟動(dòng)子分段缺失是研究相關(guān)的順式作用元件的有效方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建FUL一系列啟動(dòng)子分段缺失片段及內(nèi)含子載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因、GUS活性分析等技術(shù)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可得到以下結(jié)論：

擬南芥FUL啟動(dòng)子上游調(diào)控序列?2 148 bp～?1 987 bp區(qū)能夠抑制其自身啟動(dòng)子的活性，而將?2 148 bp～?1 987 bp區(qū)連接到啟動(dòng)子TUBULIN和ACTIN中則不能抑制它們的活性。這說(shuō)明FUL啟動(dòng)子上游調(diào)控序列?2 148 bp～?1 987 bp區(qū)的抑制作用不具有普遍性，很可能是擬南芥中某個(gè)抑制FUL基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的特異結(jié)合區(qū)域。PFUL2244(?2 148 bp～+96 bp) 在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段無(wú)GUS活性，表明在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段FUL啟動(dòng)子及上游調(diào)控區(qū)(?2 148 bp～+96 bp) 無(wú)法啟動(dòng)GUS表達(dá)，直至轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)階段，莖生葉和花器官中才有GUS活性，這與Jefferson等[25]的研究一致，他們將2.3 kbFUL啟動(dòng)子融合GUS基因，轉(zhuǎn)基因擬南芥在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段沒(méi)有GUS活性，而一旦轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)，在花分生組織和新生的莖生葉中表現(xiàn)出GUS活性。本實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因植株P(guān)FUL2083 (?1 987 bp～+96 bp) 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的子葉、幼小蓮座葉、莖以及生殖生長(zhǎng)階段的莖生葉、萼片均有 GUS活性。根據(jù) Mandel和Yanofsky[1]研究表明AP1抑制FUL在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的表達(dá)，直到轉(zhuǎn)為生殖生長(zhǎng)階段在花分生組織發(fā)育到第 3階段時(shí)FUL才開(kāi)始大量上調(diào)表達(dá)，并且在新生的莖生葉中FUL也開(kāi)始表達(dá)。綜上，我們認(rèn)為?2 148 bp～?1 987 bp及其附近區(qū)域很可能就是轉(zhuǎn)錄因子AP1的結(jié)合位點(diǎn)。但是對(duì)于AP1是否真正作用于此區(qū)域，直接作用，還是與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后再作用于此位點(diǎn)等問(wèn)題還有待下一步深入研究。

FUL上游調(diào)控序列?1 484 bp～?1 028 bp區(qū)也能夠抑制自身啟動(dòng)子的活性，其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。?378 bp～+96 bp區(qū)不能單獨(dú)啟動(dòng)FUL表達(dá)，表明這是啟動(dòng)子最基本的核心區(qū)域。序列分析表明FUL啟動(dòng)子在?1 916 bp～?1 737 bp區(qū)含有2個(gè)CArG-box。CArG-box是具有MADS結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，具有序列保守性，一般為 CC(A/T)6GG[28]。將?1 916 bp～?1 737 bp刪除，則PFUL△CArG失去啟動(dòng)活力，說(shuō)明對(duì)于FUL啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)，這 2個(gè)CArG-box起到很重要的作用。但是很難解釋的是，更短的FUL啟動(dòng)子缺失表達(dá)載體雖然不含這 2個(gè)CArG-box卻能啟動(dòng)GUS的表達(dá)。這暗示了在靠近基本啟動(dòng)子的區(qū)域有與這 2個(gè) CArG-box共同起作用的順式作用元件，它們與轉(zhuǎn)錄因子相互作用形成復(fù)雜的復(fù)合體，共同調(diào)控基因表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)研究還表明FUL的第一內(nèi)含子參與FUL的表達(dá)調(diào)控。Deyholos和Sieburth的研究表明擬南芥AG基因的第二內(nèi)含子具有調(diào)控功能，其 3′端序列對(duì)于激活A(yù)G的早期表達(dá)和調(diào)控AG在心皮中的表達(dá)有重要作用，而 5′端的序列對(duì)AG在雄蕊中的表達(dá)更為重要[29]。AG-Like基因與AG基因有一定的序列相似性，調(diào)控元件也有一定保守性，AG-Like基因的內(nèi)含子中大多至少包含一個(gè)CArG-box[30]。根據(jù)PLACE Web Signal Scan序列分析表明FUL(AGL8)的第一內(nèi)含子內(nèi)部存在2個(gè)CArG-box (圖7)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明FUL的第一內(nèi)含子對(duì)擬南芥從幼蕾期到角果伸長(zhǎng)期的心皮發(fā)育起調(diào)控作用，并且隨著發(fā)育的進(jìn)行，調(diào)控的區(qū)域逐漸向心皮兩端集中。而且FUL的第一內(nèi)含子也參與雄蕊花粉絲的發(fā)育。這與AG的第二內(nèi)含子的調(diào)控模式比較相似。另外，F(xiàn)UL的第一內(nèi)含子具有類(lèi)似增強(qiáng)子的作用，其增強(qiáng)作用通過(guò)轉(zhuǎn)基因植株P(guān)TUB+Intron1和PACT+Intron1的GUS活性得到驗(yàn)證。表明Intron1有普遍的增強(qiáng)表達(dá)的作用。而且 Intron1+mini35S單獨(dú)啟動(dòng)GUS表達(dá)的能力比CaMV35S 還要強(qiáng)，如圖5e所示，轉(zhuǎn)基因植株的葉片、莖、花器官中的萼片、心皮都有比較深的染色。并且GUS定量分析的結(jié)果也驗(yàn)證了其啟動(dòng)GUS的能力比CaMV35S 還要強(qiáng)。所以有可能將FUL的Intron1+mini35S開(kāi)發(fā)成像CaMV35S一樣的通用啟動(dòng)子，但這有待于進(jìn)一步的驗(yàn)證。

總之，我們驗(yàn)證了在FUL啟動(dòng)子的上游存在2個(gè)抑制FUL表達(dá)的順式作用元件，并且其中一個(gè)很可能與轉(zhuǎn)錄因子AP1的結(jié)合有關(guān)。在FUL上游調(diào)控序列的2個(gè)CArG-box，對(duì)FUL的啟動(dòng)活性起到重要作用。FUL基因的第一內(nèi)含子參與擬南芥心皮和雄蕊的發(fā)育調(diào)控，而且有增強(qiáng)基因表達(dá)的作用。對(duì)于FUL基因表達(dá)模式的研究有利于將其更好地應(yīng)用于作物新品種的培育，如通過(guò)在油菜上過(guò)表達(dá)FUL或其同源基因可防止油菜角果開(kāi)裂，其他木本植物如桃、蘋(píng)果和樺樹(shù)的FUL同源基因的異源表達(dá)，能促進(jìn)早花，改變植株形態(tài)，減少二級(jí)分枝。相信隨著FUL基因的深入研究，必將在農(nóng)作物增產(chǎn)、品種改良方面作出重大貢獻(xiàn)。

REFERENCES

[1] Mandel MA, Yanofsky MF. TheArabidopsis AGL8 MADSbox gene is expressed in inflorescence meristems and is negatively regulated byAPETALA1.Plant Cell, 1995, 7:1763?1771.

[2] Litt A, Irish VF. Duplication and diversification in theAPETALA1/FRUITFULLfloral homeotic gene lineage:implications for the evolution of floral development.Genetics, 2003, 165: 821?833.

[3] Thei?en G. Development of floral organ identity: stories from the MADS house.Curr Opin Plant Biol, 2001,4:75?85.

[4] Coen ES, Meyerowitz EM. The war of the whorls: Genetic interactions controlling flower development.Nature, 1991,353: 31?37.

[5] Kempin SA, Savidge B, Yanofsky MF. Molecular basis of the cauliflower phenotype inArabidopsis.Science, 1995,267: 522?525.

[6] Ferrándiz C, Gu Q, Martienssen R,et al.Redundant regulation of meristem identity and plant architecture byFRUITFULL,APETALA1andCAULIFLOWER.Development, 2000, 127: 725?734.

[7] Alvarez J, Guli CL, Yu XH,et al.Terminal flower: a gene affecting inflorescence development inArabidopsis thaliana.Plant J, 1992, 2(1): 103?116.

[8] Borner R, Kampmann G, Chandler J,et al.A MADSdomain gene involved in the transition to flowering inArabidopsis.Plant J, 2000,24(5): 591?599.

[9] Melzer S, Lens F, Gennen J,et al. Flowering-time genes modulate meristem determinacy and growth form inArabidopsis thaliana.Nature Genetics, 2008, 40:1489?1492.

[10] Ferrándiz C, Pelaz S, Yanofsky MF. Control of carpel and fruit development inArabidopsis.Annu Rev Biochem,1999, 68: 321–354.

[11] Bamnolker PT, Samach A. The flowering integrator FT regulatesSEPALLATA3andFRUITFULLaccumulation inArabidopsisleaves.Plant Cell, 2005, 17: 2661?2675.

[12] Gu Q, Ferrándiz C, Yanofsky MF,et al. TheFRUITFULLMADS-box gene mediates cell differentiation duringArabidopsisfruit development.Development, 1998, 125:1509?1511.

[13] Liljegren SJ, Ditta GS, Eshed Y,et al.SHATTERPROOFMADS-box genes control seed dispersal inArabidopsis.Nature, 2000, 404: 766?770.

[14] Liljegren, SJ, Roeder A, Kempin S,et al. Control of fruit patterning inArabidopsisbyINDEHISCENT.Cell, 2004,116(6): 843?853.

[15] Rajani S, Sundaresan V. TheArabidopsismyc/bHLH geneALCATRAZenables cell separation in fruit dehiscence.Curr Biol, 2001, 11(24): 1914?1922.

[16] Ferrándiz C, Liljegren SJ, Yanofsky MF. Negative regulation of theSHATTERPROOFgenes byFRUITFULLduringArabidopsisfruit development.Science, 2000,289:436?438.

[17] Roeder A., Ferrándiz C, Yanofsky MF. The role of the REPLUMLESS homeodomain protein in patterning theArabidopsisfruit.Curr Biol, 2003, 13(18): 1630?1635.

[18] Jack T. Plant development going MADS.Plant Mol Biol,2001,46: 515–520.

[19] Chandler J, Corbesier L, Spielmann P,et al.Modulating flowering time and prevention of pod shatter in oilseed rape.Mol Breed, 2005, 15: 87–94.

[20] Kabsch W, Vandekerckhove J. Structure and function of actin.Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1992, 21: 49?76.

[21] Kopczak SD, Haas NA, Hussey PJ,et al.The small genome ofArabidopsiscontains at least six expressed[alpha]-Tubulingenes.Plant Cell, 1992, 4(5): 539?547.

[22] Riechmann JL, Meyerowitz EM. MADS domain proteins in plant development.Biol Chem, 1997, 378: 1079–1101.

[23] Zhang JD, Lu LT, Ji LS,et al. Functional characterization of a tobacco matrix attachment region-mediated enhancement of transgene expression.Transgenic Res,2009, 18: 377?385.

[24] Clough SJ, Bent AF. Floral dip: a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.Plant J, 1998, 16: 735?743.

[25] Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW. GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J, 1987, 6(13): 3901?3907.

[26] Gallagher SR. GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression. San Diego, CA: Academic Press Inc, 1992: 47?59.

[27] Zhu C, Perry SE. Control of expression and autoregulation ofAGL15, a member of the MADS-box family.Plant J,2005, 41: 583?594.

[28] Miwa T, Kedes L. Duplicated CArG box domains have positive and mutually dependent regulatory roles in expression of the human alpha-cardiac actin gene.Mol Cell Biol, 1987, 7(8): 2803?2813.

[29] Deyholos MK, Sieburth LE. Separable whorl-specific expression and negative regulation by enhancer elements within theAGAMOUSsecond intron.Plant Cell, 2000,12(10): 1799?1810.

[30] Parcy F, Nilsson O, Busch MA,et al. A genetic framework for floral patterning.Nature, 1998, 395(6702): 561?566.

Regulation pattern of theFRUITFULL(FUL) gene ofArabidopsis thaliana

Tingting Chu1,2, Hua Xie1,2, Yong Xu2, and Rongcai Ma1,2

1College of Life Science,Capital Normal University,Beijing100048,China
2Beijing Agro-Biotechnology Research Center,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Beijing100097,China

Received:March 18, 2010;Accepted:May 24, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB1087).

Corresponding author:Rongcai Ma. E-mail: marc@bjny.gov.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2007CB1087) 資助。